Summary
Den nuværende protokol beskriver en forbedret metode til ADSC-isolering, hvilket resulterer i et enormt cellulært udbytte med tidsgevinst sammenlignet med litteraturen. Denne undersøgelse giver også en ligetil metode til at opnå et relativt stort antal levedygtige celler efter langvarig kryopræservering.
Abstract
Humane mesenkymale stamceller afledt af fedtvæv er blevet mere og mere attraktive, da de viser passende egenskaber og er en tilgængelig kilde til regenerative kliniske anvendelser. Forskellige protokoller er blevet brugt til at opnå fedtafledte stamceller. Denne artikel beskriver forskellige trin i en forbedret tidsbesparende protokol for at opnå en mere betydelig mængde ADSC, der viser, hvordan man kryopreserverer og optøer ADSC for at opnå levedygtige celler til dyrkningsudvidelse. Et hundrede milliliter lipoaspirat blev opsamlet ved hjælp af en 26 cm tre-huls og 3 mm kaliber sprøjte fedtsugning fra abdominalområdet hos ni patienter, der efterfølgende gennemgik elektiv abdominoplastik. Stamcelleisoleringen blev udført med en række vaske med Dulbeccos fosfatbuffered saltvand (DPBS) opløsning suppleret med calcium og brug af collagenase. Stromal vaskulær fraktion (SVF) celler blev kryopræserveret, og deres levedygtighed blev kontrolleret ved immunophenotyping. SVF-cellulært udbytte var 15,7 x 105 celler / ml, der spænder mellem 6,1-26,2 celler / ml. Vedhæftede SVF-celler nåede sammenløb efter et gennemsnit på 7,5 (±4,5) dage med et gennemsnitligt cellulært udbytte på 12,3 (± 5,7) x 105 celler / ml. Levedygtigheden af optøet SVF efter 8 måneder, 1 år og 2 år varierede mellem 23,06%-72,34% med et gennemsnit på 47,7% (±24,64) med den laveste levedygtighed korreleret med tilfælde af toårig frysning. Brugen af DPBS-opløsning suppleret med hviletider for calcium og poser til fedtudfældning med en kortere tid med kollagenasefordøjelse resulterede i et øget stamcelle endeligt cellulært udbytte. Den detaljerede procedure for opnåelse af høje udbytter af levedygtige stamceller var mere effektiv med hensyn til tid og cellulært udbytte end teknikkerne fra tidligere undersøgelser. Selv efter en lang periode med kryopræservering blev der fundet levedygtige ADSC-celler i SVF.
Introduction
Humane mesenkymale stamceller er fordelagtige i både grundforskning og anvendt forskning. Brugen af denne voksne celletype overgår etiske spørgsmål - sammenlignet med brugen af embryonale eller andre celler - er et af de mest lovende studieområder inden for autolog vævsregenereringsteknik og celleterapi1, såsom det neoplastiske område, behandling af degenerative sygdomme og terapeutiske anvendelser inden for rekonstruktiv kirurgiområde 2,3,4, 5. Det er tidligere blevet rapporteret, at der er en rigelig kilde til mesenkymale multipotente og pluripotente stamceller i den stromale vaskulære cellefraktion af fedtvæv 6,7. Disse ADSC betragtes som gode kandidater til brug i celleterapi og transplantation/infusion, da et betydeligt antal celler med en stærk ekspansionskapacitet ex vivo let kan opnås med et højt udbytte fra en minimal invasiv procedure 5,8.
Det blev også påvist, at fedtvæv har større kapacitet til at tilvejebringe mesenkymale stamceller end to andre kilder (knoglemarv og navlesnorsvæv)9. Udover at være dårligt immunogen og have en høj evne til at integrere sig i værtsvævet og interagere med det omgivende væv4,10, har ADSC en multipotent differentieringskapacitet i cellelinjer med rapporter om kondrogen, osteogen og myogen differentiering under passende kulturbetingelser11,12,13 og i celler, såsom bugspytkirtel, hepatocytter, og neurogene celler14,15,16.
Det videnskabelige samfund er enige om, at de mesenkymale stamcellers immunmodulerende virkning er en mere relevant virkningsmekanisme for celleterapi17,18,19 end deres differentieringsegenskab. En af de mest betydningsfulde fordele ved ADSC-brugen er muligheden for autolog infusion eller podning, der bliver en alternativ behandling for flere sygdomme. Til regenerativ medicin er ADSC allerede blevet brugt i tilfælde af leverskader, rekonstruktion af hjertemuskulatur, regenerering af nervevæv, forbedring af skeletmuskelfunktion, knogleregenerering, kræftbehandling og diabetesbehandling20,21.
Til denne dato er der 263 registrerede kliniske forsøg til evaluering af ADSC's potentiale, der er anført på webstedet for United States National Institutes of Health22. Forskellige protokoller til høst af fedtvæv er blevet etableret, men der er ingen konsensus i litteraturen om en standardiseret metode til at isolere ADSC til klinisk brug23,24. Lipoaspiratbehandlingsmetoder under og efter operationen kan direkte påvirke cellens levedygtighed, det endelige cellulære udbytte25 og kvaliteten af ADSC-populationen20. Med hensyn til den kirurgiske forbehandling er det ikke veletableret, hvilken kirurgisk forbehandlingsteknik der giver et større antal levedygtige celler efter isolering, eller om den bedøvelsesopløsning, der injiceres i fedtvæv, påvirker celleudbyttet og dets funktioner26. Tilsvarende kan forskellen mellem teknikker til opnåelse af fedtceller føre til så meget som et fald på 70% i antallet af levedygtige ADSC20. Ifølge litteraturen bør mekaniske behandlinger for at opnå cellepopulationer med høj levedygtighed - herunder ultralyd - undgås, for de kan nedbryde fedtvævet20. Imidlertid er den manuelle fedtaspirationsmetode med sprøjter mindre skadelig og forårsager mindre celledestruktion, hvor tumescent fedtsugning giver et betydeligt antal celler med den bedste kvalitet26.
Denne teknik bruger en saltopløsning med lidokain og adrenalin, der injiceres i fedtsugningsområdet. For hver 3 ml injektionsvolumen opløsning opsuges 1 ml. I denne undersøgelse blev den våde fedtsugningsteknik udført, hvor der for hver 1 ml adrenalin og saltopløsning, der injiceres, aspireres 0,2 ml fedtvæv. Anvendelsen af fordøjelsesenzymer, især collagenase, er almindelig for processen med at isolere ADSC.
Efter det første isoleringstrin i laboratoriet kaldes den endelige pellet stromal vaskulær fraktion (SVF). Den indeholder forskellige celletyper27, herunder endotelprecursorceller, endotelceller, makrofager, glatte muskelceller, lymfocytter, pericytter, præ-adipocytter og ADSC'er, som er i stand til vedhæftning. Når den endelige isolering er afsluttet fra in vitro-kulturer , elimineres celler, der ikke klæber til plasten, i mellemstore udvekslinger. Efter otte ugers ekspansion, mellemstore ændringer og passager repræsenterer ADSC'er det meste af cellepopulationen i kolberne20. En af de væsentligste fordele ved at anvende isolerede fedtafledte stamceller til en mulig fremtidig behandling er muligheden for kryopræservering. Det blev påvist, at kryopræserveret lipoaspirat er en potentiel kilde til SVF-celler, selv efter 6 ugers frysning28, med biologisk aktivitet selv efter 2 års kryopræservering29 og fuld evne til at vokse og differentiere i kultur30. Under optøningsprocessen går en betydelig procentdel af cellerne imidlertid normalt tabt31. Derfor skal lipoaspiratfjernelsesprocessen og følgende metoder til celleisolering sikre det højeste celleudbytte.
Denne undersøgelse beskriver en hurtigere metode til indsamling og isolering af ADSC, der viser højt cellulært udbytte og levedygtighed for bedre effektivitet af cellulær terapi. Desuden blev effekten af denne forbedrede teknik efter langvarig SVF-kryopræservering evalueret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse er godkendt af UNIFESP's etiske komité (protokolnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), udført efter indhentning af skriftligt informeret samtykke fra patienterne i henhold til Helsinki-erklæringen (2004). Prøven af denne undersøgelse består af ni kvindelige patienter i alderen 33-50 år (gennemsnitsalder 41,5) og gennemsnitligt initial body mass index (BMI) på 24,54 (mellem 22,32-26,77) (tabel 1), der gennemgik æstetisk abdominoplastik på grund af overskydende hud efter graviditeter, ved Division of Plastic Surgery ved Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brasilien. For at reducere bias blev patienterne udvalgt som en homogen gruppe under hensyntagen til køn, alder og BMI. De datasæt, der blev brugt og/eller analyseret under denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter rimelig anmodning.
1. Indsamling af lipoaspirat
BEMÆRK: Dette trin skal udføres i operationscentret.
- Brug 4% chlorhexidingluconat (se materialetabel) til hudforberedelse og asepsis.
- Udfør et 2 mm subkutant hudsnit (mellem sub-dermis og aponeurose). Indsæt en Klein-kanyle på 26 mm 3 G tre-huls og 3 mm kaliber og en sprøjte for at injicere et samlet volumen på 500 ml af en adrenalinopløsning (1 mg / ml) (se materialetabel) fortyndet i saltvand (1: 1.000.000) i det infraumbiliske område.
- Tilslut en 60 ml sprøjte til en 26 mm 3 G tre-huls og 3 mm kaliber fedtsugningskanyle og indsæt den gennem hudsnittet, lås stemplet for at skabe et vakuum.
- Lav skubbe- og trækbevægelser, så lipoaspiratet forbliver i 60 ml sprøjten, når vakuumet skabes.
- Brug et sterilt stik med en ventil til at overføre de 100 ml af det opsamlede lipoaspirat til en 150 ml polyvinylchloridoverførselspose (se Materialetabel).
- Pak overførselsposen i en polystyrenkasse ved stuetemperatur (~ 25 ° C) og tag den straks til laboratoriet. Det tager ikke længere tid end 30 minutter at starte vævsbehandlingen.
2. Behandling af lipoaspirat
BEMÆRK: Dette trin skal udføres i laboratoriet.
- Vej først posen, mål temperaturen med et digitalt berøringsfrit infrarødt klinisk termometer, og lad posen hvile i 5 minutter inde i det laminære strømningskammer til udfældning af de fedtede lag (bobler) og vævsadskillelse indeholdende cellerne af interesse.
- Udfør en række vævsvask. Første vask: Injicer 100 ml DPBS med calcium (1x) i overførselsposen og bland det med hænderne.
- Lad det stå i 5 min og fjern det meste af den basale væske, der udfældes.
- Kassér basalvæsken med en 60 ml sprøjte fastgjort til poseadapteren. Denne proces skal gentages to gange.
- Der tilsættes 100 ml fordøjelsesopløsning i posen (93 ml calciumfri DPBS + 60 μL calciumchlorid (1 g/l) + 7 ml steril collagenase, se materialetabel) og efterlades ved 37 °C i 30 minutter under langsom omrøring.
- Overfør alt posens indhold til fire koniske rør på 50 ml og centrifuger dem ved 400 x g ved 22 °C i 10 min.
- Fjern og kassér supernatanten og tilsæt 5 ml Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) lav glucose suppleret med 20% FBS (Føtalt bovin serum) til cellepellet (figur 1).
3. Optælling af SVF-cellerne
- Bland en frisk opløsning af 10 μL trypanblå ved 0,05% i destilleret vand med 10 μL cellulær suspension i 5 min.
- Tæl levedygtige celler i et Neubauer-celletællingskammer32 ved hjælp af et omvendt lysmikroskop (se Materialetabel) ved 20x forstørrelse.
- Cellepelleten resuspenderes i et kryobeskyttende medium (5 ml FBS + 10% dimethylsulfoxid - DMSO) i en koncentration på 1 x 106 celler/ml.
- Placer 1 ml af denne blanding i cryovials. Brug en frysebeholder (se Materialeoversigt) med en kølehastighed på (1 °C/min til -80 °C).
- Opbevares ved -80 °C i 1 år.
- Efter dette tidspunkt opbevares i standardkassettebokse nedsænket i væskenitrogendampfasen (-165 °C).
4. Optøningsproces af cellerne
- Fjern hætteglassene fra flydende nitrogen, og læg dem straks i 37 °C vandbadet i 1 min.
- Svf-cellerne anbringes i et konisk rør med 4 ml DMEM (lav glukose suppleret med 20% FBS) forvarmet ved 37 °C.
- Centrifuge ved 400 x g ved 22 °C i 5 min.
- Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml DMEM (lav glukose) + 10% FBS. Udfør immunophenotyping ved at følge nedenstående trin.
5. Flowcytometri teknik (immunophenotype multipel mærkning)
- Placer 1 ml cellepellet (koncentration af 1.000 celler / μL) i fem cytometrirør (200 μL hver).
- Der centrifugeres ved 400 x g ved 22 °C i 5 minutter, og supernatanten kasseres med en pipette.
- Der tilsættes 300 μL phosphatbufferet saltvand (PBS) (10x), centrifuge ved 400 x g ved 22 °C og supernatanten kasseres med en pipette.
- Forbered fem rør til forskellige markørkombinationer som følger: 5 μL CD11B / 5 μL CD19/20 μL CD45; 5 μL CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45 Cellelevedygtighedsanalyse-5 μL fluorescerende reaktivt farvestof. (se Materialetabel) og et rør med ufarvede celler og PBS som negativ kontrol. Homogeniser i en hvirvel og inkuberes ved 4 °C i 30 min.
- Der centrifugeres ved 400 x g ved 22 °C i 5 minutter, supernatanten kasseres med en pipette, der tilsættes 500 μL PBS (10x), og cellesorteringen fortsættes.
BEMÆRK: Fem tusinde hændelser erhverves pr. antistof, der er indstillet i flowcytometeret i fire farver og fem parametre og analyseres med CellQuest-software.
- Der centrifugeres ved 400 x g ved 22 °C i 5 minutter, supernatanten kasseres med en pipette, der tilsættes 500 μL PBS (10x), og cellesorteringen fortsættes.
6. Såning af passage 1 (P1)
- Frø 2 x 105 celler i en 75 cm2 kulturkolbe.
- Tilsæt 12 ml DMEM lav glucose + 20% FBS + 10% antibiotikum / antimykotisk (med 10.000 enheder penicillin, 10 mg streptomycin og 25 μg amphotericin B pr. ml, 0,1 μm).
- Når cellerne når mellem 80% -90% sammenløb, skal du udføre trypsinisering af klæbende celler med 2 ml 0,25% EDTA-trypsin i 3 min.
- Tæl celler igen (som nævnt i trin 3).
- Udfør immunophenotyping igen (som nævnt i trin 5).
7. Statistisk analyse
- Brug Spearmans Rho-lommeregner33 til at måle styrken af sammenhængen mellem følgende variabler med P < 0,05, som nævnt nedenfor.
- Vælg SVF-cellulært udbytte, og antallet af dage SVF forbliver i kultur i den første passage (P1) indtil 80% -90% sammenløb (dage til P1).
- Vælg SVF cellulært udbytte før og efter at have gået til P1.
- Overvej dage til P1 og cellulært udbytte, før du går til P1.
- Vælg SVF-cellulært udbytte med den gennemsnitlige procentdel af bekræftet ADSC.
- Beregn procentdelen af bekræftet ADSC og det cellulære udbytte, før du går til P1.
- Bestem BMI og SVF cellulært udbytte.
8. Differentieringsanalyse
- Udfør differentieringsanalysen efter en differentieringssætprotokol (se Tabel over materialer). Figur 4 viser resultaterne for sag 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakteriseringen af de ni undersøgte personer, herunder deres alder, vægt, højde og BMI, er vist i tabel 1.
Ifølge det cellulære udbytte, der oprindeligt blev præsenteret, blev cellevolumenet, der blev podet i kultur, beregnet til at være så tæt som muligt på kapaciteten af den 75 cm2 dyrkningskolbe. Den prøvemængde, der i hvert enkelt tilfælde er sået, er beskrevet i tabel 2. Derefter blev der ifølge det oprindelige cellulære udbytte bestemt et variabelt volumen celler for hver prøve: 1 ml for prøver med højere cellulært udbytte, 1,1 ml for prøver med mellemliggende cellulært udbytte og 2 ml for prøver med lavere cellulært udbytte for at udføre mere lignende cellesåning mellem tilfælde. Da kulturen nåede ca. 80% -90% sammenløb (figur 2A) (ca. 7,5 ± 4,5 dage), blev trypsinisering af klæbende celler udført (tabel 2 og figur 2B).
Det cellulære udbytte før passage 1 varierede stort set, selv når den samme sammenløb før trypsinisering blev observeret (tabel 2). Dette kan forklares ved, at celler kan være vokset i lag. Forskellige parametre fra patienternes ADSC blev også vurderet i forskellige perioder, som det fremgår af tabel 2.
Nogle prøver (sag 1, sag 2, sag 7) kunne ikke evalueres med hensyn til procentdelen af bekræftet ADSC og det anslåede antal ADSC i kultur på grund af bakterieforurening og mangel på tilgængelige celler til at udføre kryopræserveret SVF-immunophenotyping. Ifølge Spearmans Rho-lommeregner 33 blev der ikke fundet statistiske forskelle mellem SVF-cellulært udbytte og dage til P1 (r = 0,37816, p = 0,31561), mellem SVF-cellulært udbytte før og efter at have gået til P1 (r = -0,33333, p = 0,38071) og mellem dage til P1 og cellulært udbytte, før de gik til P1 (r = -0,53783, p = 0,13529). Desuden blev der ikke observeret signifikante forskelle, når man korrelerede SVF-cellulært udbytte med den gennemsnitlige procentdel af bekræftet ADSC (r = -0,02857, p = 0,95716) og mellem den gennemsnitlige procentdel af bekræftet ADSC og det cellulære udbytte, før de gik til P1 (r = 0,42857, p = 0,3965). Korrelationen mellem BMI og SVF cellulært udbytte kunne heller ikke betragtes som statistisk signifikant (r = -0,46667, p = 0,20539). Tabel 3 viser flowcytometriske data udført på SVF-celler kryopræserveret. De oprindelige SVF-celler indeholdt en delmængde af positive celler til hæmatopoietiske markører (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. Fra den oprindelige SVF-cellepopulation udtrykte en bestemt undergruppe CD11b 34 og CD1934 stromale celleassocierede markører. Niveauerne CD73 34, CD90 34 og CD10534 var mellemliggende mellem disse værdier. Den oprindelige SVF indeholdt en underpopulation af celler, der var positive for stamcelleassocierede markører (figur 3). Et gennemsnit på 79 % af SVF'erne udtrykte den HSC-associerede markør CD3434.
I alt var der brug for 21 minutter til de tre vaske, 30 minutter til kollagenasefordøjelse, 10 minutter til centrifugering og 5 minutter til celletælling og plettering.
Figur 1: Trin fra protokollens fedtafledte stamcelleisolering . (A) Taske til lipoaspirattransport i et lukket system. (B) Hvileposens trin gentages tre gange efter vask. (C) Lipoaspirate efter tre vaske med DPBS. (D) Lipoaspirat efter kollagenasefordøjelse. (E) Lipoaspirat efter fordøjelsen fordeles i et 50 ml rør. (F) Fordøjet lipoaspirat efter centrifugering. (G) Endelig procesisolering med pellet med stromal vaskulær fraktion (SVF). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfologi og levedygtighed af ADSC'er . (A) Plastiske klæbende mesenkymale fedtafledte stamceller ved den første passage efter isolering ved lysmikroskopi. Cellerne viser vedhæftning til den plastiske og fibroblastlignende morfologi. (B) Trypanblå assay, der viser levedygtige celler talt i Neubauer-kammeret ved hjælp af et lysmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Subpopulation af celler, der er positive for stamcelleassocierede markører i SVF i tilfælde 9 efter 8 måneders kryopræservering. R1: Samlet cellulært område analyseret i FSC (Forward Scatter) x SSC (Side Scatter) (Størrelse x Kompleksitet); R2: CD45 negativ region, hvis befolkninger CD73, CD90 og CD105 er positive i denne region. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Differentieringsanalyse . (A) ADSC-differentiering i kondrocytter. (B) ADSC-differentiering i osteocytter. (C) ADSC-differentiering i adipocytter. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Patient | Alder ved indsamling (år) | Vægt (kg) | Højde (meter) | BMI* |
| Tilfælde 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| Tilfælde 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| Tilfælde 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| Tilfælde 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| Tilfælde 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| Sag 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| Sag 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| Tilfælde 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| Tilfælde 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
Tabel 1: Data fra prøverne af de undersøgte personer. *BMI: body mass index.
| Patient | Samlet mængde (ml) | SVF cellulært udbytte (celle/ml) (x 105) | Volumen i kultur (ml) | Gennemsnitlig procentdel af bekræftet ADSC (%) | Antal celler i indledende dyrkning (x 105) | Anslået antal ADSC i kultur (x 105) | Dage til P1 | Cellulært udbytte, før du går til P1 (x 105) |
| Tilfælde 1 | 96 | 9.2 | 2 | Na | 18.4 | Na | 10 | 18 |
| Tilfælde 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| Tilfælde 3 | 100 | 26.2 | 1 | Na | 26.2 | Na | 12 | 6.6 |
| Tilfælde 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| Tilfælde 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| Sag 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| Sag 7 | 98 | 6.8 | 2 | Na | 13.6 | Na | 8 | 10.5 |
| Tilfælde 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| Tilfælde 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| SD | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
Tabel 2: Data fra forskellige trin i proceduren fra de ni analyserede patienter. SVF: stromal vaskulær fraktion; ADSC: fedtafledt stamcelle; P1: passage 1; NA: Data foreligger ikke.
| PRØVE | % ADSC BESTEMT VED MONOKLONALE ANTISTOFFER | % AF HÆMATOPOIETISKE CELLER BESTEMT VED MONOKLONALE ANTISTOFFER | CELLELEVEDYGTIGHEDSANALYSE OG TIDSPUNKT FOR SVF-KRYOPRÆSERVERING | |||||||||
| CD45-(*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | Betyde | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | LIVE/DØD + | |||
| Tilfælde 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39,54% (2 år) | ||
| Tilfælde 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38,30% (2 år) | ||
| Tilfælde 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23,06% (2 år) | ||
| Sag 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56,76% (2 år) | ||
| Tilfælde 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55,56% (1 år) | ||
| Tilfælde 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72,34% (8 måneder) | ||
Tabel 3: Flowcytometridata fra seks af patienterne. (*) Ud fra disse CD45-celler blev % af ADSC med forskellige kombinationer af stamcellemarkører bestemt. ADSC: fedtafledt stamcelle; SVF: stromal vaskulær fraktion; (*) Ud fra disse CD45-celler blev % af ADSC med forskellige kombinationer af stamcellemarkører bestemt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering udbytte
Det er veletableret, at kryopræserveringsprocessen, der ofte kræves i cellulær terapi, resulterer i signifikant celletab, undertiden større end 50% 29,30,35. Således er en teknisk forbedring for at opnå højt indledende cellulært udbytte isoleret set grundlæggende. Indsamlingsmetoden for lipoaspirat og isolationsmetoden for cellerne skal fokusere på at bevare et større antal celler, opretholde høj levedygtighed og ekstrahere det maksimale antal celler fra det oprindelige materiale, samtidig med at der tages højde for den langsigtede kultur og manipulation af cellerne. Derfor er det nødvendigt med lige kulturvedligeholdelse for at holde cellerne væk fra apoptose, ældning eller genetisk ustabilitet, da celleterapi sandsynligvis vil være effektiv og sikker for patienterne.
Så vidt vi ved, er der ingen tidligere artikel, der bruger dette sæt trin til isolering af mesenkymale stamceller afledt af lipoaspirat, hvilket resulterer i en tidsbesparende og cost-benefit-teknik. I denne undersøgelse blev hvert metodologisk trin begrundet i henhold til litteraturen, der viste det højeste endelige celleudbytte i cellulær isolation. Nyheden i den teknik, der blev udført i denne undersøgelse, var brugen af manuel aspiration forbundet med en række lipoaspiratvasker, med den efterfølgende taske hvilende. Indsamlingsposen, der blev brugt til at transportere og behandle lipoaspirat, tillod ufordøjede vævsfragmenter ikke at deltage i kollagenasefordøjelsen. Det mest kritiske trin er at tilføje calciumchlorid til den friske fordøjelsesopløsning, da det forstærker virkningen af collagenase. Tidsgevinsten er endnu ikke rapporteret i litteraturen med en celleoptøningsmetode, der tillader levedygtige celler selv efter lang kryopræserveringstid. SVF-cellulært udbytte, der blev fundet i denne undersøgelse, varierede bredt fra 6,15 til 26,2 x 10 5 celler / ml med et gennemsnit på 15,7 x 105 celler / ml. Dette kan skyldes tilstedeværelsen af en mere signifikant mængde adrenalinopløsning suget, som kan have været højere eller lavere i henhold til stadiet af den kirurgiske procedure og antallet af andre kendte celletyper, der generelt findes i SVF. Selvom nogle undersøgelser har fundet negative korrelationer mellem BMI og ADSC-udbytte 36,37, fandt denne undersøgelse ingen signifikant korrelation, ligesom de to andre undersøgelser38,39, hvilket reducerede muligheden for, at det var årsagen til den utrolige variation af SVF-cellulært udbytte, der findes i denne undersøgelse. Disse data viser, at det laveste SVF-cellulære udbytte opnået var 6,15 x 105 celler / ml. Nogle undersøgelser havde allerede målt effektiviteten af ADSC-isolering i henhold til den kirurgiske teknik til opnåelse af lipoaspirat. En undersøgelse opnåede 0,087 x 10 5 celler / ml i frisk isoleret SVF til fedtsugningsteknikken ved hjælp af adrenalinopløsning (som anvendt i denne undersøgelse) og 0,143 x 105 celler / ml uden det26. Dette arbejde fremhævede betydningen af adrenalininjektionen på grund af den vasokonstriktive virkning, der reducerer intraoperativ blødning og blå mærker, som de fleste kirurger vælger at udføre i klinisk praksis. En anden undersøgelse viste, at isolerede levende ADSC'er varierede fra 0 til 0,59 x 10 5 celler / g lipoaspirat høstet, med et gennemsnit på 0,295 (±0,25) x 105 celler / g væv31. Nogle undersøgelser har testet forskellige måder at opnå højere ADSC-udbytte på. En af disse undersøgelser opnåede ca. 350 x 105 for metoden, der præsenterede forskellige bestanddele i collagenasefordøjelsesbuffer og brugen af en orbital shaker40. En anden undersøgelse viste 29,7 (±0,2) x 105 celler / ml som det samlede antal SVF-celler fra abdominalområdet41. Det abdominale område, der er valgt i denne undersøgelse, er stadig referenceområdet for den bedste tilgængelighed og tilgængelighed af lipoaspirat42. Kropsregionen til lipoaspiratindsamling, blandt andre faktorer som donoralder og metode for den valgte indsamling, er en stærk determinant for kvaliteten af ADSC-udbyttet.
Muligheden for, at mikroorganismers forurening forårsagede utilgængelighed af celler til at fortsætte eksperimenterne, var det eneste udførelsesproblem, der begrænsede færdiggørelsen af denne undersøgelse. Selv ved hjælp af antibiotika og krav til god fremstillingspraksis kan forurening forekomme på grund af manglen på et totalt aseptisk miljø til at udføre aspirationen af fedt.
SVF immunphenotyping
Ifølge The Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy 34 er et af de tre minimale kriterier for at definere humane mesenkymale stamceller, at cellerne skal udtrykke CD105 34, CD73 34 og CD90 34 og ikke bør udtrykke CD45 34, CD34 34, CD14 34 eller CD11b 34, CD79a 34 eller CD19 34, og HLA-DR34 overflademembranmolekyler. Mitchell43 testede friske SVF-celler ved immunophenotyping og fandt maksimalt 54% af cellerne med ADSC-overflademarkører. I denne undersøgelse afslørede immunophenotypningen en højere procentdel af bekræftet ADSC (ikke-hæmatopoietiske celler) på op til 78,91% i SVF efter langvarig kryopræservering (fra 37,95% -78,91% med et gennemsnit på 53,68%). Beviser viser, at forfædrene til en stamcellepopulation, der endnu ikke er begået, ikke udtrykker CD34-markøren34,44,45. Afhængigt af differentieringsstadiet kan CD3434 negative stamceller generere ikke kun hæmatopoietiske forfædre, men også mere specifikke mesenkymale forstadier, såsom osteoklaster, chondrocytter, myocytter, adipocytter og andre. Nogle undersøgelser viste den slående plasticitet af den primitive stamcellepopulation, sammensat af celler med stromalcellefunktion og hæmatopoietiske og mesenkymale forfædre45. Ifølge litteraturen er den komplette CD3434 funktionelle rolle i vævsdannelsen i SVF-celler stadig ukendt46. Mitchell43 viste et gennemsnit på 60% celler af SVF, der udtrykte CD3434-markør, mens gennemsnittet i denne undersøgelse var 78,81%. Det er kendt, at udtrykket af CD3434 overflademarkør falder langs passager.
Klæbende celler og differentieringsassay
Afhængigt af antallet af celler opnået efter isolering varierede antallet af celler podet i den første kultur. Den første dyrkningstid for at nå 80% -90% sammenløb i 75 cm2 kolber tog i gennemsnit 8,4 dage og en standardafvigelse på 7,5 (±4,5) dage fra 6,6 til 16,1 x 105 celler / ml. Det skal bemærkes, at selv for tilfælde med lavere cellulært udbytte førte den første kulturtid til høje cellulære udbytteindekser sammenlignet med litteraturen, sandsynligvis på grund af den bedste tilgængelighed af levedygtige celler, der opretholdes under hele indsamlings- og isoleringsprocessen. En undersøgelse opnåede et cellulært udbytte på 3,75 (±1,42) x 105 ADSC pr. ml lipoaspirat inden for en 4,1 (±0,7) dages kulturperiode47. En anden undersøgelse viste et udbytte af nukleerede SVF-celler på 3,08 (±1,40) x 105 pr. millimeter med et gennemsnit på 6,0 (±2,4) dage i den første dyrkningsperiode43. I denne undersøgelse blev det ved at estimere antallet af ADSC podet i kultur, som varierede som en funktion af antallet af celler observeret i SVF fra samlingen af det samme volumen på 100 ml lipoaspirat, at antallet af dage til at nå P1 ikke havde nogen relation til cellevolumen. For eksempel for tilfælde 9, hvor 12,2 x 105 celler blev inkuberet, var det nødvendigt med 6 dage for at nå 80% -90% sammenløb. For tilfælde 6, hvor 14,6 x 105 celler blev podet i kultur, var det nødvendigt med en længere periode (10 dage) for at nå op til det samme niveau af sammenløb. Måske er et minimum ADSC-nummer nok til den første vedhæftningsperiode. Der kan være betydelig variation mellem individer, såsom comorbiditeter, alder og generel sundhedsstatus. Nogle undersøgelser i litteraturen satte spørgsmålstegn ved vigtigheden af at overveje patienternes interindividuelle variabilitet for SVF-celleudbytte48,49.
Ifølge The Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy34 skal mesenkymale celler have evnen til at differentiere sig i tre forskellige celletyper som osteogene, adipogene og chondrogene afstamninger, som det blev demonstreret i figur 4.
Cellelevedygtighed, kryopræservering og genetisk ustabilitet
Forskellige metoder er blevet brugt til at bestemme levedygtighedstab, defineret som plasmamembranintegritetsskade50. Kulturerne kan dog også præsentere tidlige apoptotiske celler, som disse tilgange kan ignorere, fordi de opretholder en intakt plasmamembran, men de er ikke levedygtige. De resultater, der rapporteres her, viser et stort interval i levedygtighedsmarkør, fra 23,06% -72,34%, med et gennemsnit på 47,6% efter langvarig kryopræservering. I betragtning af at kryopræservering er et vigtigt skridt vedrørende celleterapi, er genopretning af det maksimale antal levedygtige og funktionelle stamceller efter optøning et af de prioriterede spørgsmål for succesen med celleterapi. Litteraturen har vist, at mindst 50% af cellelevedygtigheden går tabt fra 1-4 måneder efter kryopræservering43. Især er de laveste indekser, der præsenteres i denne undersøgelse, fra Case 5, Case 4 og Case 2, som er de ældste kryopræserverede prøver (ca. 2 år). Selvom de præsenterede de laveste levedygtighedsindekser, viste de højt cellulært udbytte i trypanblå farvestofudelukkelsesanalyse i frisk SVF. Selv om litteraturen understøtter årsager til tab af levedygtighed, er disse satser lavere end forventet. Temperaturudsving i celleopbevaring på grund af tekniske årsager kan forårsage stigning og ophobning af stress og favorisere akkumulering af vandige portioner, hvilket genererer krystaller, der beskadiger plasmamembranen under langvarig kryopræservering51. Litteraturen viser mere end 70% levedygtighed for prøver med samme eller længere frysetid. Levedygtighedskontrollen blev imidlertid udført med en anden teknik end den, der blev udført i denne undersøgelse52. En anden undersøgelse viste, at længere kryopræservering påvirker cellulær levedygtighed31 negativt, hvilket kan forklares ved temperaturvariationer i -80 °C fryseren. Derfor skal celler ofte forblive for længe i kultur, hvilket øger cellecyklusstress, hvilket medfører risici for genetisk ustabilitet og følgelig kompromitterer cellulær terapi. Der er også enighed i litteraturen, der angiver nogle stressfaktorer, og hvordan de påvirker cellecytogenetisk stabilitet, hvilket er afgørende for at opretholde den langvarige stamcelledyrkning, der kræves til celleterapi35,53.
Metodens fordel
Til dato viser litteraturen ingen standardiseret protokol til isolering af ADSC med henblik på kliniske anvendelser. De fleste af undersøgelserne viser komplekse, tidskrævende protokoller24. I denne undersøgelse skal effektiviteten af metoden versus den tid, der kræves for at fuldføre det oprindelige cellulære udbytte, understreges: ca. 1,5 timer. Ifølge litteraturen kan isolering af fedtafledte stamceller tage ca. 3 timer til 8 timer54,55. Således er gevinsten af tid allieret med den høje cellulære indkomst afgørende for regenerativ medicin terapeutisk fremskridt. Der bør foretages flere vurderinger af cellelevedygtigheden parallelt med dem, der udføres i dette arbejde for at forbedre denne metode. Yderligere randomiserede kontrollerede forsøg, der indeholder en mere omfattende prøve ved hjælp af denne metode, er nødvendige for at kontrasignere disse resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker de patienter, der frivilligt deltog og det medicinske og sygeplejepersonale på Hospital São Paulo. Denne undersøgelse blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasilien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
- Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
- Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
- Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
- Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
- Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
- Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
- Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
- Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
- Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
- Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
- Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
- Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
- Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
- Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
- El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
- Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
- US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
- Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
- Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
- Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
- Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
- Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
- Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
- Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
- Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
- Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
- Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
- Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
- Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
- Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
- Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
- Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
- Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
- Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
- Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
- Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
