Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

טכניקה לקבלת תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן ואפיון שבר כלי דם סטרומלי בשימור בהקפאה ארוכת טווח

Published: December 30, 2021 doi: 10.3791/63036
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 2, 1, 2, 3, 1
1Genetics Division, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech, São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה משופרת לבידוד ADSC וכתוצאה מכך תפוקה תאית אדירה עם רווח בזמן בהשוואה לספרות. מחקר זה מספק גם שיטה פשוטה להשגת מספר גדול יחסית של תאים בני קיימא לאחר שימור בהקפאה לטווח ארוך.

Abstract

תאי גזע מזנכימליים אנושיים שמקורם ברקמת שומן הפכו לאטרקטיביים יותר ויותר ככל שהם מראים תכונות מתאימות ומהווים מקור נגיש ליישומים קליניים רגנרטיביים. פרוטוקולים שונים שימשו להשגת תאי גזע שמקורם בשומן. מאמר זה מתאר שלבים שונים של פרוטוקול משופר לחיסכון בזמן כדי להשיג כמות משמעותית יותר של ADSC, ומראה כיצד לשמר ולהפשרה של ADSC כדי להשיג תאים בני קיימא להרחבת התרבית. מאה מיליליטר של lipoaspirate נאספו, באמצעות 26 ס"מ שלושה חורים ו 3 מ"מ מזרק שאיבת שומן, מאזור הבטן של תשעה חולים שעברו לאחר מכן abdominoplasty אלקטיבי. בידוד תאי הגזע בוצע באמצעות סדרה של שטיפות עם תמיסת מלח חצוב פוספט (DPBS) של דולבקו, בתוספת סידן ושימוש בקולגן. תאי שבר כלי דם סטרומליים (SVF) הוקפאו, ויכולת הקיום שלהם נבדקה על ידי אימונופנוטיפ. התפוקה התאית של SVF הייתה 15.7 x 105 תאים למ"ל, ונעה בין 6.1-26.2 תאים למ"ל. תאי SVF דבקים הגיעו למפגש לאחר ממוצע של 7.5 (±4.5) ימים, עם תפוקה תאית ממוצעת של 12.3 (± 5.7) x 105 תאים למ"ל. הכדאיות של SVF מופשר לאחר 8 חודשים, שנה ושנתיים נעה בין 23.06%-72.34% עם ממוצע של 47.7% (±24.64) עם הכדאיות הנמוכה ביותר בקורלציה עם מקרים של הקפאה של שנתיים. השימוש בתמיסת DPBS בתוספת סידן וזמני מנוחה של שקיות למשקעי שומן עם זמן קצר יותר של עיכול קולגן הביא לתפוקה מוגברת של התאים הסופיים של תאי גזע. ההליך המפורט להשגת תשואות גבוהות של תאי גזע בני קיימא היה יעיל יותר לגבי זמן ותפוקת תאים מאשר הטכניקות ממחקרים קודמים. גם לאחר תקופה ארוכה של שימור בהקפאה, נמצאו תאי ADSC בני קיימא ב-SVF.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים אנושיים הם יתרון הן במחקר בסיסי והן במחקר יישומי. השימוש בסוג תא בוגר זה גובר על סוגיות אתיות - בהשוואה לשימוש בתאים עובריים או אחרים - בהיותו אחד מתחומי המחקר המבטיחים ביותר בהנדסת התחדשות רקמות אוטולוגיתוטיפול בתאים 1, כגון האזור הניאופלסטי, הטיפול במחלות ניווניות ויישומים טיפוליים באזור הניתוח המשחזר 2,3,4, 5. בעבר דווח כי קיים מקור שופע של תאי גזע רב-פוטנטיים ופלוריפוטנטיים מזנכימליים בחלק תאי כלי הדם הסטרומליים של רקמת השומן 6,7. ADSC אלה נחשבים למועמדים מצוינים לשימוש בטיפול בתאים והשתלה / עירוי מכיוון שניתן להשיג בקלות מספר לא מבוטל של תאים עם יכולת הרחבה ex vivo עם תשואה גבוהה מהליך זעיר פולשני 5,8.

כמו כן, הוכח כי רקמת השומן מציגה יכולת גדולה יותר לספק תאי גזע מזנכימליים מאשר שני מקורות אחרים (מח עצם ורקמת חבל הטבור)9. מלבד היותו אימונוגני גרוע ובעל יכולת גבוהה להשתלב ברקמה המארחת ולתקשר עם הרקמות הסובבות4,10, ל- ADSC יש יכולת רב-תכליתית של התמיינות לקווי תאים, עם דיווחים על התמיינות כונדרוגנית, אוסטאוגנית ומיוגנית בתנאי תרבית מתאימים11,12,13, ולתוך תאים, כגון לבלב, הפטוציטים, ותאים נוירוגניים14,15,16.

הקהילה המדעית מסכימה כי האפקט החיסוני של תאי גזע מזנכימליים הוא מנגנון פעולה רלוונטי יותר לטיפול בתאים17,18,19 מאשר תכונת ההתמיינות שלהם. אחד היתרונות המשמעותיים ביותר של השימוש ב- ADSC הוא האפשרות של עירוי אוטולוגי או השתלה, להיות טיפול חלופי למספר מחלות. עבור רפואה רגנרטיבית, ADSC כבר שימשו במקרים של נזק לכבד, שחזור של שריר הלב, התחדשות של רקמת עצבים, שיפור תפקוד שרירי השלד, התחדשות העצם, טיפול בסרטן, וטיפול בסוכרת20,21.

נכון להיום, ישנם 263 ניסויים קליניים רשומים להערכת הפוטנציאל של ADSC, המפורטים באתר האינטרנט של המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית22. פרוטוקולים שונים לקצירת רקמת שומן נקבעו, אך אין קונצנזוס בספרות על שיטה סטנדרטית לבידוד ADSC לשימוש קליני23,24. שיטות עיבוד Lipoaspirate במהלך הניתוח ולאחריו יכולות להשפיע ישירות על כדאיות התא, על התפוקה התאית הסופית25, ועל איכות אוכלוסיית ADSC20. באשר לטיפול המקדים הניתוחי, לא ברור איזו טכניקת טרום-טיפול כירורגית מניבה מספר משמעותי יותר של תאים בני קיימא לאחר הבידוד או שמא תמיסת ההרדמה המוזרקת לרקמת השומן משפיעה על תפוקת התא ועל תפקודו26. באופן דומה, ההבדל בין טכניקות להשגת תאי שומן יכול להוביל לירידה של עד 70% במספר ADSC20 בר קיימא. על פי הספרות, יש להימנע מטיפולים מכניים להשגת אוכלוסיות תאים עם כדאיות גבוהה - כולל אולטרסאונד, שכן הם יכולים לפרק את רקמת השומן20. עם זאת, שיטת שאיפת השומן הידנית עם מזרקים מזיקה פחות, וגורמת לפחות הרס תאים, כאשר שאיבת שומן סרטנית מניבה מספר משמעותי של תאים באיכות הטובה ביותר26.

טכניקה זו משתמשת בתמיסת מלח עם לידוקאין ואפינפרין המוזרק לאזור שאיבת השומן. עבור כל נפח 3 מ"ל של תמיסה מוזרק, 1 מ"ל הוא aspirated. במחקר זה בוצעה טכניקת שאיבת השומן הרטובה, שבה עבור כל 1 מ"ל של אדרנלין ותמיסת מלח מוזרקת, 0.2 מ"ל של רקמת שומן הוא שאפתן. השימוש באנזימי עיכול, במיוחד קולגן, נפוץ בתהליך בידוד ADSC.

לאחר שלב הבידוד הראשון במעבדה, הכדור הסופי נקרא שבר כלי דם סטרומלי (SVF). הוא מכיל סוגי תאים שונים27, כולל תאים מבשרי אנדותל, תאי אנדותל, מקרופאגים, תאי שריר חלק, לימפוציטים, פריציטים, קדם-אדיפוציטים ו- ADSCs, המסוגלים להידבק. לאחר סיום הבידוד הסופי מתרביות מבחנה , תאים שלא דבקו בפלסטיק מסולקים בחילופים בינוניים. לאחר שמונה שבועות של התרחבות, שינויים בינוניים ומעברים, ADSCs מייצגים את רוב אוכלוסיית התאים בבקבוקונים20. אחד היתרונות המשמעותיים ביותר של שימוש בתאי גזע בודדים שמקורם בשומן לטיפול עתידי אפשרי הוא האפשרות של שימור בהקפאה. הודגם כי ליפואספירציה בהקפאה היא מקור פוטנציאלי לתאי SVF גם לאחר 6 שבועות של הקפאה28, עם פעילות ביולוגית גם לאחר שנתיים של שימור בהקפאה29, ויכולת מלאה לגדול ולהתמיין בתרבית30. עם זאת, במהלך תהליך ההפשרה, אחוז ניכר של תאים הוא איבד בדרך כלל31. לכן, תהליך הסרת lipoaspirate ואת השיטות הבאות של בידוד התא חייב להבטיח את תפוקת התא הגבוהה ביותר.

מחקר זה מתאר מתודולוגיה מהירה יותר לאיסוף ובידוד ADSC, המדגימה תפוקה תאית גבוהה וכדאיות ליעילות טובה יותר של טיפולים תאיים. יתר על כן, ההשפעה של טכניקה משופרת זו לאחר שימור בהקפאה ארוך טווח של SVF נבדקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר הנוכחי מאושר על ידי ועדת האתיקה של UNIFESP (מספר פרוטוקול: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), שבוצע לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב מהמטופלים על פי הצהרת הלסינקי (2004). המדגם של המחקר הנוכחי מורכב מתשע מטופלות, בגילאי 33-50 שנים (גיל ממוצע 41.5) ומדד מסת גוף ראשוני ממוצע (BMI) של 24.54 (נע בין 22.32-26.77) (טבלה 1) שעברו ניתוח אב-נופלסטי אסתטי עקב עודף עור לאחר הריונות, במחלקה לכירורגיה פלסטית של האוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו (UNIFESP), ברזיל. כדי להפחית את ההטיה, המטופלים נבחרו כקבוצה הומוגנית בהתחשב במין, גיל ו- BMI. מערכי הנתונים שבהם נעשה שימוש ו/או נותחו במהלך מחקר זה זמינים מהמחבר המתאים על פי בקשה סבירה.

1. אוסף של lipoaspirate

הערה: שלב זה צריך להתבצע במרכז הניתוח.

  1. יש להשתמש ב-4% כלורהקסידין גלוקונאט (ראו טבלת חומרים) להכנת העור ואספסיס.
    1. לבצע חתך עור תת עורי של 2 מ"מ (בין תת הדרמיס לאפונורוזיס). הכנס צינורית קליין של 26 מ"מ 3 G שלושה חורים וקליבר 3 מ"מ ומזרק כדי להזריק נפח כולל של 500 מ"ל של תמיסת אדרנלין (1 מ"ג / מ"ל) (ראה טבלת חומרים) מדולל מלוחים (1:1,000,000) באזור האינפראומביל.
  2. חברו מזרק 60 מ"ל לצינורית שאיבת שומן בקוטר 26 מ"מ 3 G ו-3 מ"מ והחדירו אותה דרך החתך בעור, תוך נעילת הבוכנה ליצירת ואקום.
    1. בצע תנועות דחיפה ומשיכה כך שעם הוואקום שנוצר, lipoaspirate נשאר במזרק 60 מ"ל.
  3. באמצעות מחבר סטרילי עם שסתום, העבר את 100 מ"ל של lipoaspirate שנאסף לשקית העברה פוליוויניל כלוריד 150 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
    1. ארזו את שקית ההעברה בקופסת פוליסטירן בטמפרטורת החדר (~25 מעלות צלזיוס) וקחו אותה מיד למעבדה. אין ליטול יותר מ-30 דקות כדי להתחיל בעיבוד הרקמות.

2. עיבוד של lipoaspirate

הערה: יש לבצע שלב זה במעבדה.

  1. ראשית, שקלו את השקית, מדדו את הטמפרטורה באמצעות מדחום קליני דיגיטלי ללא מגע, והשאירו את השקית מונחת במשך 5 דקות בתוך תא הזרימה הלמינרית למשקעים של השכבות השמנוניות יותר (בועות) והפרדת רקמות המכילה את התאים המעניינים.
    1. בצע סדרה של שטיפות רקמות. כביסה ראשונה: להזריק 100 מ"ל של DPBS עם סידן (1x) לתוך שקית ההעברה ומערבבים אותו עם הידיים.
    2. תן לו לעמוד במשך 5 דקות ולהסיר את רוב הנוזל הבסיסי כי מזרז.
    3. השליכו את הנוזל הבסיסי עם מזרק של 60 מ"ל המחובר למתאם השקית. יש לחזור על תהליך זה פעמיים.
  2. הוסיפו 100 מ"ל של תמיסת עיכול לשקית (93 מ"ל של DPBS ללא סידן + 60 מיקרוגרם כלוריד (1 גרם לליטר) + 7 מ"ל של 0.075% קולגן סטרילי, ראו טבלת חומרים) והשאירו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בערבוב איטי.
  3. העבירו את כל תכולת השקית לארבעה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-400 x גרם ב-22 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    1. הסר והשליך את הסופרנטנט והוסף 5 מ"ל של הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו עם גלוקוז נמוך בתוספת 20% FBS (סרום בקר עוברי) לכדור התא (איור 1).

3. ספירת תאי SVF

  1. יש לערבב תמיסה טרייה של 10 μL בצבע כחול טריפאן ב-0.05% במים מזוקקים עם 10 μL של תרחיף סלולרי למשך 5 דקות.
  2. ספירת תאים בני קיימא בתא ספירת תאים של נויבאואר32 באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך (ראו טבלת חומרים) בהגדלה של פי 20.
  3. יש להשעות את כדור התא במדיום מגן קריופטי (5 מ"ל של FBS + 10% של דימתיל סולפוקסיד - DMSO) בריכוז של 1 x 106 תאים למ"ל.
  4. מניחים 1 מ"ל של תערובת זו cryovials. השתמש במיכל הקפאה (ראה טבלת חומרים) עם קצב קירור של (1 °C לדקה עד -80 °C).
    1. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C למשך שנה.
    2. לאחר זמן זה, אחסן בקופסאות קלטות סטנדרטיות שקועות בשלב אדי החנקן הנוזלי (-165 מעלות צלזיוס).

4. תהליך הפשרה של התאים

  1. הסר את הבקבוקונים מחנקן נוזלי והנח אותם מיד באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
  2. מניחים את תאי ה-SVF בצינור חרוטי עם 4 מ"ל של DMEM (גלוקוז נמוך בתוספת 20% FBS) שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. צנטריפוגה ב 400 x גרם ב 22 °C למשך 5 דקות.
  4. הסר את הסופרנטנט והוסף 1 מ"ל של DMEM (גלוקוז נמוך) + 10% FBS. בצע אימונופנוטיפינג לפי השלבים הבאים.

5. טכניקת ציטומטריה של זרימה (תיוג מרובה אימונופנוטיפ)

  1. מניחים 1 מ"ל של כדור התא (ריכוז של 1,000 תאים/μL) בחמש צינוריות ציטומטריה (200 μL כל אחת).
  2. צנטריפוגה ב 400 x גרם ב 22 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant עם פיפטה.
  3. הוסף 300 μL של תמיסת מלח עם פוספט (PBS) (10x), צנטריפוגה ב-400 x g ב-22°C והשלך את הסופר-נאטנט עם פיפטה.
  4. הכן חמישה צינורות לשילובי סמנים שונים כדלקמן: 5 μL של CD11B / 5 μL של CD19/20 μL של CD45; 5 μL של CD73/20 μL של CD90/5 μL של CD105/20 μL של CD45; 20 μL של CD34/5 μL של HLA-DR/20 μL של CD45; בדיקת כדאיות התא-5 μL של צבע תגובתי פלואורסצנטי. (ראה טבלת חומרים) וצינור עם תאים לא מוכתמים ו- PBS כבקרה שלילית. הומוגניות במערבולת ודוגרת ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    1. צנטריפוגה ב 400 x גרם ב 22 ° C במשך 5 דקות, להשליך את supernatant עם פיפטה, להוסיף 500 μL של PBS (10x), ולהמשיך עם מיון תאים.
      הערה: חמשת אלפים אירועים נרכשים לכל ערכת נוגדנים בציטומטר זרימה של ארבעה צבעים וחמישה פרמטרים ומנותחים באמצעות תוכנת CellQuest.

6. זריעת קטע 1 (עמ' 1)

  1. זרעים 2 x 105 תאים בבקבוק תרביתבגודל 75 ס"מ 2.
  2. הוסף 12 מ"ל של DMEM גלוקוז נמוך + 20% של FBS + 10% אנטיביוטיקה / אנטימיקוטי (עם 10,000 יחידות פניצילין, 10 מ"ג סטרפטומיצין, ו 25 מיקרוגרם אמפוטריצין B למ"ל, 0.1 מיקרומטר).
  3. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-90%, בצע טריפסיניזציה של תאים דבקים עם 2 מ"ל של 0.25% EDTA-טריפסין למשך 3 דקות.
  4. ספירת תאים שוב (כפי שצוין בשלב 3).
  5. בצע אימונופנוטיפינג שוב (כפי שצוין בשלב 5).

7. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש במחשבון Rho33 של ספירמן כדי למדוד את חוזק הקשר בין המשתנים הבאים עם P < 0.05, כפי שצוין להלן.
    1. בחר תפוקת תאי SVF ואת מספר הימים שבהם SVF נשאר בתרבית במעבר הראשון (P1) עד למפגש של 80%-90% (ימים עד P1).
    2. בחר תפוקת סלולר SVF לפני ואחרי מעבר ל-P1.
    3. קחו בחשבון ימים ל-P1 ולתפוקה התאית לפני שאתם עוברים ל-P1.
    4. בחר תפוקה סלולרית של SVF עם האחוז הממוצע של ADSC מאושר.
    5. חשב את אחוז ה- ADSC המאושר ואת התפוקה התאית לפני שתעבור ל- P1.
    6. קבע את התפוקה התאית של BMI ו- SVF.

8. מבחן בידול

  1. בצע את בדיקת ההבחנה בהתאם לפרוטוקול ערכת בידול (ראה טבלת חומרים). איור 4 מדגים את התוצאות עבור מקרה 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האפיון של תשעת הפרטים שנחקרו, כולל גילם, משקלם, גובהם ו-BMI, מוצגים בטבלה 1.

על פי התפוקה התאית שהוצגה בתחילה, נפח התאים שחוסנו בתרבית חושב להיות קרוב ככל האפשר לקיבולת של בקבוק תרבית2 75 ס"מ. נפח הדגימה שנזרע בכל מקרה מתואר בטבלה 2. לאחר מכן, על פי התפוקה התאית הראשונית, נקבע נפח משתנה של תאים עבור כל דגימה: 1 מ"ל עבור דגימות עם תפוקה תאית גבוהה יותר, 1.1 מ"ל עבור דגימות עם תפוקה תאית בינונית, ו-2 מ"ל עבור דגימות עם תפוקה תאית נמוכה יותר כדי לבצע זריעת תאים דומה יותר בין מקרים. כאשר התרבית הגיעה למפגש של 80%-90% (איור 2A) (כ-7.5 ±-4.5 ימים), בוצע טריפסיניזציה של תאים דבקים (טבלה 2 ואיור 2B).

התפוקה התאית לפני מעבר 1 השתנתה באופן נרחב גם כאשר נצפה אותו מפגש לפני טריפסיניזציה (טבלה 2). זה יכול להיות מוסבר על ידי העובדה כי תאים עשויים לגדול בשכבות. פרמטרים שונים מה-ADSC של המטופלים הוערכו גם בתקופות שונות, כפי שהוכח בטבלה 2.

חלק מהדגימות (מקרה 1, מקרה 2, מקרה 7) לא ניתן היה להעריך לגבי אחוז ה- ADSC המאושר והמספר המשוער של ADSC בתרבית עקב זיהום חיידקים והיעדר תאים זמינים לביצוע אימונופנוטיפ SVF בהקפאה. על פי מחשבון Rho 33 של ספירמן, לא נמצאו הבדלים סטטיסטיים בין תפוקת תאי SVF לבין ימים ל- P1 (r = 0.37816, p = 0.31561), בין תפוקה סלולרית SVF לפני ואחרי מעבר ל- P1 (r = -0.33333, p = 0.38071), ובין ימים ל- P1 ותפוקה תאית לפני מעבר ל- P1 (r = -0.53783, p = 0.13529). יתר על כן, לא נצפו הבדלים משמעותיים כאשר מתאמים את התפוקה התאית SVF עם האחוז הממוצע של ADSC מאושר (r = -0.02857, p = 0.95716) ובין האחוז הממוצע של ADSC מאושר לבין התשואה התאית לפני המעבר ל- P1 (r = 0.42857, p = 0.3965). כמו כן, המתאם בין BMI לתפוקה תאית SVF לא יכול להיחשב מובהק סטטיסטית (r = -0.46667, p = 0.20539). טבלה 3 מציגה נתונים ציטומטריים של זרימה המבוצעים על תאי SVF בהקפאה. תאי ה-SVF הראשוניים הכילו תת-קבוצה של תאים חיוביים עבור סמנים המטופויאטיים (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. מאוכלוסיית תאי SVF הראשונית, תת-קבוצה מסוימת ביטאה סמנים הקשורים לתאים סטרומליים CD11b 34 ו- CD1934. הרמות של CD73 34, CD90 34 ו- CD10534 היו ביניים בין ערכים אלה. ה-SVF הראשוני הכיל תת-אוכלוסייה של תאים חיוביים עבור סמנים הקשורים לתאי גזע (איור 3). ממוצע של 79% מה-SVFs ביטא את הסמן הקשור ל-HSC CD3434.

בסך הכל, 21 דקות היו נחוצות לשלוש השטיפות, 30 דקות לעיכול קולגן, 10 דקות לצנטריפוגה ו -5 דקות לספירת תאים וציפוי.

Figure 1
איור 1: שלבים מהפרוטוקול של בידוד תאי גזע שמקורם בשומן . (A) תיק להובלה של ליפו-אספירטים במערכת סגורה. (ב) שלב שקית המנוחה חזר על עצמו שלוש פעמים, לאחר הכביסה. (C) Lipoaspirate לאחר שלוש שטיפות עם DPBS. (D) Lipoaspirate לאחר עיכול קולגן. (E) Lipoaspirate לאחר העיכול מופץ בצינור 50 מ"ל. (F) ליפואספירציה מעוכלת לאחר צנטריפוגה. (G) בידוד התהליך הסופי עם הכדור עם שבר כלי הדם הסטרומלי (SVF). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מורפולוגיה וכדאיות של ADSCs . (A) תאי גזע שמקורם בשומן מזנכימלי מפלסטיק במעבר הראשון לאחר בידוד במיקרוסקופיית אור. התאים מראים הידבקות למורפולוגיה הפלסטית ודמוית הפיברובלסט. (B) בדיקה כחולה טריפאן המציגה תאים בני קיימא שנספרו בתא נויבאואר באמצעות מיקרוסקופ אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תת-אוכלוסייה של תאים חיוביים עבור סמנים הקשורים לתאי גזע ב-SVF של מקרה 9 לאחר 8 חודשים של שימור בהקפאה. R1: האזור התאי הכולל שנותח ב-FSC (פיזור קדימה) x SSC (פיזור צד) (גודל x סיבוכיות); R2: אזור שלילי CD45, שאוכלוסייתו CD73, CD90 ו- CD105 חיוביות באזור זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: בדיקת הבחנה . (A) התמיינות ADSC בכונדרוציטים. (B) התמיינות ADSC באוסטאוציטים. (C) הבחנה ADSC באדיפוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מטופל גיל באוסף (שנים) משקל (ק"ג) גובה (מטר) BMI*
מקרה 1 35 68 1.64 25.28
מקרה 2 33 65 1.65 23.88
מקרה 3 35 70 1.68 24.8
מקרה 4 34 72 1.64 26.77
מקרה 5 36 72 1.69 25.21
מקרה 6 36 67 1.64 24.91
מקרה 7 38 62 1.53 26.49
מקרה 8 50 63 1.68 22.32
מקרה 9 37 65 1.58 26.04

טבלה 1: נתונים מהדגימות של הפרטים שנחקרו. *BMI: מדד מסת הגוף.

מטופל נפח שנאסף (מ"ל) תפוקה סלולרית SVF (תא/מ"ל) (x 105) נפח בתרבות (mL) אחוז ממוצע של ADSC מאושר (%) מספר התאים בתרבית ראשונית (x 105) מספר משוער של ADSC בתרבית (x 105) ימים עד P1 תפוקה סלולרית לפני מעבר ל-P1 (x 105)
מקרה 1 96 9.2 2 נה 18.4 נה 10 18
מקרה 2 100 25.2 1 38 25.2 9.6 12 10.8
מקרה 3 100 26.2 1 נה 26.2 נה 12 6.6
מקרה 4 105 21.1 1 55.9 21.1 11.8 3 13.1
מקרה 5 110 23.7 1 61.4 23.7 14.5 4 16.1
מקרה 6 100 13.3 1.1 78.9 14.6 11.5 10 13.5
מקרה 7 98 6.8 2 נה 13.6 נה 8 10.5
מקרה 8 100 9.7 1.1 44.2 10.7 4.7 11 6.9
מקרה 9 100 6.1 2 43.8 12.2 5.3 6 15.9
SD 3.89 7.81 0.46 13.75 5.55 3.53 3.2 3.79

טבלה 2: נתונים משלבים שונים של ההליך מתשעת המטופלים שנותחו. SVF: שבר כלי דם סטרומלי; ADSC: תא גזע שמקורו בשומן; P1: קטע 1; NA: הנתונים אינם זמינים.

לדוגמה % של ADSC נקבע על ידי נוגדנים חד שבטיים % מהתאים ההמטופוייטיים שנקבעו על ידי נוגדנים חד שבטיים בדיקת כדאיות התא וזמן הקפאת SVF
CD45-(*) CD73+/CD90+ CD73+/CD105+ CD105+/CD90+ התכוון CD34+ HLA-DR+ CD11b+ CD19+ חי/מת +
מקרה 2 52.34% 31.97% 25.36% 56.52% 37.95% 63.16% 12.87% 2.41% 0.21% 39.54% (שנתיים)
מקרה 4 48.02% 61.62% 40.93% 65.25% 55.93% 82.94% 26.62% 0.00% 0.16% 38.30% (שנתיים)
מקרה 5 27.74% 54.02% 49.72% 80.42% 61.38% 73.33% 51.31% 0.05% 0.00% 23.06% (שנתיים)
מקרה 6 55.52% 79.52% 67.70% 89.52% 78.91% 86.86% 8.83% 0.18% 1.06% 56.76% (שנתיים)
מקרה 8 57.28% 46.84% 30.88% 57.65% 45.12% 78.47% 26.97% 0.03% 0.00% 55.56% (שנה אחת)
מקרה 9 56.14% 47.52% 36.30% 47.69% 43.83% 88.10% 26.94% 0.05% 0.24% 72.34% (8 חודשים)

טבלה 3: נתוני ציטומטריה של זרימה משישה מהמטופלים. (*) מתאי CD45 אלה נקבע % של ADSC עם שילובים שונים של סמני תאי גזע. ADSC: תא גזע שמקורו בשומן; SVF: שבר כלי דם סטרומלי; (*) מתאי CD45 אלה נקבע % של ADSC עם שילובים שונים של סמני תאי גזע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תשואת בידוד
ידוע כי תהליך ההקפאה, הנדרש לעתים קרובות בטיפול תאי, גורם לאובדן תאים משמעותי, לעתים גדול מ-50%29,30,35. לפיכך, שיפור טכני להשגת תפוקה סלולרית ראשונית גבוהה בבידוד הוא בסיסי. שיטת האיסוף של lipoaspirate ושיטת הבידוד של התאים חייבים להתמקד בשימור מספר גדול יותר של תאים, שמירה על כדאיות גבוהה, וחילוץ המספר המרבי של תאים מהחומר הראשוני תוך התחשבות בתרבית ארוכת טווח ומניפולציה של התאים. לכן, נדרשת תחזוקה של תרבית ישרה כדי להרחיק את התאים מאפופטוזיס, סנסנציה או חוסר יציבות גנטית, שכן טיפול בתאים עשוי להיות יעיל ובטוח לחולים.

למיטב ידיעתנו, אין מאמר קודם שהשתמש בסדרת צעדים זו לבידוד של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בליפואספירציה, מה שמביא לטכניקה של חיסכון בזמן ועלות-תועלת. במחקר זה, כל שלב מתודולוגי הוסבר על פי הספרות שהראתה את תפוקת התאים הסופית הגבוהה ביותר בבידוד התאים. החידוש של הטכניקה שבוצעה במחקר זה היה השימוש בשאיפה ידנית הקשורה לסדרה של שטיפות lipoaspirate, עם התיק הבא נח. שקית האיסוף המשמשת להובלה ולעיבוד ליפואספירטים אפשרה לשברי רקמות לא מעוכלים לא להשתתף בעיכול קולגן. השלב הקריטי ביותר הוא הוספת סידן כלורי לתמיסת העיכול הטרייה, שכן היא מחזקת את פעולת הקולגן. העלייה בזמן עדיין לא מדווחת בספרות בשיטת הפשרת תאים המאפשרת תאים בני קיימא גם לאחר זמן הקפאה ארוך. התפוקה התאית של SVF שנמצאה במחקר זה השתנתה באופן נרחב מ-6.15 ל-26.2 x 10 5 תאים/מ"ל עם ממוצע של 15.7 x 105 תאים/מ"ל. זה יכול להיות בגלל נוכחות של כמות משמעותית יותר של תמיסת אדרנלין ינקה, אשר עשוי להיות גבוה יותר או נמוך יותר בהתאם לשלב של ההליך הכירורגי ולמספר סוגי תאים ידועים אחרים שנמצאים בדרך כלל SVF. למרות שמחקרים מסוימים מצאו מתאם שלילי בין BMI ל- ADSC תשואה של 36,37, מחקר זה לא מצא מתאם משמעותי, כמו שני המחקרים האחרים38,39, מה שמקטין את האפשרות שזה הגורם למגוון המדהיםשל תפוקת תאי SVF שנמצאו במחקר זה. נתונים אלה מראים כי התפוקה התאית הנמוכה ביותר של SVF שהתקבלה הייתה 6.15 x10 5 תאים למ"ל. כמה מחקרים כבר מדדו את היעילות של בידוד ADSC על פי הטכניקה הכירורגית לקבלת lipoaspirate. מחקר אחד השיג 0.087 x 10 5 תאים למ"ל ב- SVF מבודד טרי עבור טכניקת שאיבת שומן באמצעות תמיסת אדרנלין (כפי שנעשה שימוש במחקר זה) ו 0.143 x 105 תאים / מ"ל בלעדיו26. עבודה זו הדגישה את המשמעות של הזרקת תמיסת אדרנלין בשל ההשפעה vasoconstrictive המפחית דימום תוך ניתוחי וחבורות, כמו רוב המנתחים בוחרים לבצע בפועל קליני. מחקר אחר הראה כי ADSCs חיים שבודדו נעו בין 0 ל-0.59 x 10 5 תאים/גרם ליפואספירטים שנקטפו, עם ממוצע של 0.295 (±0.25) x 105 תאים/גרם רקמה31. מחקרים מסוימים בחנו דרכים שונות להשגת תפוקת ADSC גבוהה יותר. אחד המחקרים הללו השיג כ 350 x 105 עבור השיטה שהציגה מרכיבים שונים במאגר העיכול collagenase ושימוש בשייקר אורביטלי40. מחקר אחר הראה כי 29.7 (±0.2) x 105 תאים למ"ל הם המספר הכולל של תאי SVF מאזור הבטן41. אזור הבטן שנבחר במחקר זה הוא עדיין אזור הייחוס לזמינות ולנגישות הטובה ביותר של lipoaspirate42. אזור הגוף לאיסוף lipoaspirate, בין גורמים אחרים כמו גיל התורם ושיטת האיסוף שנבחר, הוא קובע חזק של איכות תשואות ADSC.

האפשרות שזיהום של מיקרואורגניזמים יגרום לחוסר זמינות של תאים להמשיך בניסויים הייתה בעיית הביצוע היחידה שהגבילה את השלמת המחקר הזה. אפילו באמצעות אנטיביוטיקה ודרישות תנאי ייצור נאותים, זיהום יכול להתרחש בשל היעדר סביבה אספטית מוחלטת לביצוע שאיפת השומן.

אימונופנוטיפינג SVF
על פי הוועדה לתאי גזע מזנכימליים ורקמות של האגודה הבינלאומית לטיפול תאי 34, אחד משלושת הקריטריונים המינימליים להגדרת תאי גזע מזנכימליים אנושיים הוא שהתאים חייבים לבטא CD105 34, CD73 34 ו- CD90 34 ואינם צריכים לבטא CD45 34, CD34 34, CD14 34, או CD11b 34, CD79a 34 או CD19 34, ומולקולות קרום פני השטח HLA-DR34. מיטשל43 בדק תאי SVF טריים על ידי אימונופנוטיפינג ומצא מקסימום 54% מהתאים עם סמני פני שטח ADSC. במחקר זה, האימונופנוטיפינג גילה אחוז גבוה יותר של ADSC מאושר (תאים שאינם המטופויאטיים) של עד 78.91% ב- SVF לאחר שימור בהקפאה לטווח ארוך (נע בין 37.95%-78.91% עם ממוצע של 53.68%). הראיות מראות כי אבות אבותיהם של אוכלוסיית תאי גזע שעדיין לא ביצעו אינם מבטאים את סמן CD34 34,44,45. בהתאם לשלב ההתמיינות, CD3434 תאי גזע שליליים יכולים ליצור לא רק אבות המטופויאטיים אלא גם מבשרים מזנכימליים ספציפיים יותר, כגון אוסטאוקלסטים, כונדרוציטים, מיוציטים, אדיפוציטים ואחרים. כמה מחקרים הדגימו את הפלסטיות המרשימה של אוכלוסיית תאי הגזע הפרימיטיביים, המורכבת מתאים עם תפקוד תאים סטרומליים ואבות המטופויאטיים ומזנכימליים45. על פי הספרות, התפקיד התפקודי המלא של CD3434 בהיווצרות רקמות בתאי SVF עדיין אינו ידוע46. מיטשל43 הראה ממוצע של 60% תאים של SVF המבטא סמן CD3434, בעוד שבמחקר זה, הממוצע היה 78.81%. ידוע כי הביטוי של סמן פני השטח CD3434 פוחת לאורך מעברים.

תאים דבקים ובדיקת התמיינות
בהתאם למספר התאים שהתקבלו לאחר הבידוד, מספר התאים שנזרעו בתרבית הראשונה השתנה. זמן התרבית הראשון להגעה למפגש של 80%-90% בצלוחיות בגודל 75 ס"מ2 ארך בממוצע 8.4 ימים וסטיית תקן של 7.5 (±4.5) ימים שנעה בין 6.6 ל-16.1 x 105 תאים למ"ל. יש לציין כי גם במקרים עם תפוקה תאית נמוכה יותר, זמן התרבית הראשון הוביל למדדי תפוקה תאית גבוהים בהשוואה לספרות, ככל הנראה בשל הזמינות הטובה ביותר של תאים בני קיימא שנשמרו במהלך כל תהליך האיסוף והבידוד. מחקר אחד השיג תפוקה תאית של 3.75 (±1.42) x 105 ADSC למ"ל של lipoaspirate בתוך תקופת תרבית של 4.1 (±0.7) יום47. מחקר אחר הדגים תפוקה של תאי SVF גרעיניים של 3.08 (±1.40) x 105 למילימטר עם ממוצע של 6.0 (±2.4) ימים בתקופת התרבית הראשונה43. במחקר זה, על ידי הערכת מספר ADSC שנזרעו בתרבית, אשר השתנה כפונקציה של מספר התאים שנצפו SVF מאוסף של אותו נפח של 100 מ"ל של lipoaspirate, אומת כי מספר הימים להגיע P1 אין קשר לנפח התא. לדוגמה, עבור מקרה 9, שבו 12.2 x 105 תאים היו דגירה, 6 ימים נדרשו כדי להגיע 80%-90% מפגש. עבור מקרה 6, שבו 14.6 x 105 תאים נזרעו בתרבית, היה צורך בתקופה ממושכת יותר (10 ימים) כדי להגיע עד לאותה רמה של מפגש. אולי, מספר ADSC מינימלי מספיק לתקופת ההדבקה הראשונה. תיתכן שונות בין-אישית משמעותית, כגון תחלואה נלווית, גיל ומצב בריאותי כללי. כמה מחקרים בספרות הטילו ספק בחשיבות של התחשבות בהשתנות הבין-אישית של המטופלים עבור תפוקת תאי SVF48,49.

על-פי הוועדה לתאי גזע מזנכימליים ורקמות של האגודה הבינלאומית לטיפול תאי34, לתאים מזנכימליים חייבת להיות היכולת להתמיין לשלושה סוגי תאים שונים כשושלות אוסטוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות, כפי שהודגם באיור 4.

כדאיות התאים, שימור בהקפאה וחוסר יציבות גנטית
שיטות שונות שימשו לקביעת אובדן כדאיות, המוגדר כנזק לשלמות קרום פלזמה50. עם זאת, התרביות יכולות גם להציג תאים אפופטוטיים מוקדמים שגישות אלה יכולות להתעלם מהם מכיוון שהם שומרים על קרום פלזמה שלם, אך הם אינם ניתנים להשגה. התוצאות המדווחות כאן מראות טווח גדול בסמן הכדאיות, בין 23.06%-72.34%, עם ממוצע של 47.6% לאחר הקפאה ארוכת טווח. בהתחשב בכך ששימור בהקפאה הוא צעד משמעותי בנוגע לטיפול בתאים, התאוששות של המספר המרבי של תאי גזע בני קיימא ופונקציונליים לאחר הפשרה היא אחד הנושאים העדיפים להצלחת הטיפול התאי. הספרות הראתה כי לפחות 50% מכדאיות התאים אובדת בין 1-4 חודשים לאחר שימור43. יש לציין כי המדדים הנמוכים ביותר שהוצגו במחקר זה הם ממקרה 5, מקרה 4 ומקרה 2, שהם הדגימות הוותיקות ביותר בהקפאה (כשנתיים). למרות שהם הציגו את מדדי הכדאיות הנמוכים ביותר, הם הדגימו תפוקה תאית גבוהה בבדיקת הרחקת צבע כחול טריפאן ב- SVF טרי. למרות שהספרות תומכת בסיבות לאובדן כדאיות, שיעורים אלה נמוכים מהצפוי. תנודות טמפרטורה באחסון התא עקב סיבות טכניות יכולות לגרום לעלייה והצטברות של מתח ולהעדיף הצטברות של חלקים מימיים, יצירת גבישים הפוגעים בקרום הפלסמטי במהלך שימור בהקפאה לטווח ארוך51. הספרות מראה יותר מ -70% כדאיות עבור דגימות עם זמן הקפאה זהה או ארוך יותר. עם זאת, בדיקת הכדאיות בוצעה בטכניקה שונה מזו שבוצעה במחקר זה52. מחקר אחר הראה כי שימור בהקפאה ארוך יותר משפיע לרעה על הכדאיות התאית31, אשר ניתן להסביר על ידי שינויי טמפרטורה במקפיא -80 מעלות צלזיוס. לפיכך, לעתים קרובות תאים צריכים להישאר זמן רב מדי בתרבית, מה שמגביר את הלחץ על מחזור התאים, מביא לסיכונים לחוסר יציבות גנטית וכתוצאה מכך פוגע בטיפול התאי. יש גם קונצנזוס בספרות המצביע על כמה גורמי עקה וכיצד הם משפיעים על היציבות הציטוגנטית של התא, שהיא חיונית לשמירה על טיפוח תאי גזע ממושך הנדרש לטיפול בתאים35,53.

יתרון מתודולוגיה
נכון להיום, הספרות אינה מראה פרוטוקול סטנדרטי לבידוד ADSC השואף ליישומים קליניים. רוב המחקרים מדגימים פרוטוקולים מורכבים שגוזלים זמןרב 24. במחקר זה יש להדגיש את יעילות השיטה לעומת הזמן הנדרש להשלמת התפוקה התאית הראשונית: כשעה וחצי. על פי הספרות, בידוד של תאי גזע שמקורם בשומן יכול להימשך כ-3 שעות עד 8 שעות54,55. לפיכך, רווח הזמן הקשור להכנסה התאית הגבוהה הוא קריטי לקידום הטיפולים ברפואה רגנרטיבית. יש לבצע הערכות נוספות של כדאיות התאים במקביל לאלה שבוצעו בעבודה זו כדי לשפר את השיטה. ניסויים מבוקרים אקראיים נוספים המשלבים מדגם נרחב יותר באמצעות מתודולוגיה זו נדרשים כדי לנטרל את התוצאות הללו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים למטופלים שהתנדבו להשתתף ולצוות הרפואי והסיעודי של בית החולים סאו פאולו. מחקר זה נתמך על ידי ה-Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) ו-Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), ברזיל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.8 mL cryovials Nunc Thermo Fisher Scientific 340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag JP FARMA 80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 Sigma Aldrich A5533
Adrenaline (1 mg/mL) Hipolabor NA
Alcian Blue solution Sigma Aldrich 1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x Gibco 15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis BD BioSciences NA
Calcium chloride 10% Merck 102379
Chlorhexidine gluconate 4% VIC PHARMA NA
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) Gibco 11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285601
Fetal bovine serum Gibco 10500056
Formaldehyde 4% Sigma Aldrich 1,00,496
Inverted light microscope Nikon Eclipse TS100 NA
Live and Dead Cell Assay Thermofisher 01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105 BD BioSciences 745927
Monoclonal antibody: CD11B BD BioSciences 746004
Monoclonal antibody: CD19 BD BioSciences 745907
Monoclonal antibody: CD34 BD BioSciences 747822
Monoclonal antibody: CD45 DAKO M0701
Monoclonal antibody: CD73 BD BioSciences 746000
Monoclonal antibody: CD90 BD BioSciences 553011
Monoclonal antibody: HLA-DR BD BioSciences 340827
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 Gibco  10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Gibco A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Gibco A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Gibco A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site Origen Biomedical Connector, USA NA Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4% Sigma Aldrich 93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red Gibco 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
  3. Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
  4. Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  5. Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
  6. Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  7. Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
  8. Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
  9. Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
  10. Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
  11. Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
  12. Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
  13. Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
  14. Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
  15. Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
  16. Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
  17. Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
  18. Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
  19. El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
  20. Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
  21. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
  22. US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
  23. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  24. Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
  25. Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
  26. Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
  27. Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
  28. Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
  29. Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
  30. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
  31. Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
  32. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
  33. Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
  36. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  37. Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
  38. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
  39. Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
  40. Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
  41. Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
  42. Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
  43. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  44. Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
  45. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  46. Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
  47. Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
  48. Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
  49. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
  50. Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
  51. Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
  52. Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
  53. Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
  54. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).

Tags

רפואה גיליון 178 תאי גזע מזנכימליים רקמת שומן תאי גזע שאיבת שומן בבטן טיפול בתאים פרוטוקול
טכניקה לקבלת תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן ואפיון שבר כלי דם סטרומלי בשימור בהקפאה ארוכת טווח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pola-Silva, L., Xerfan Nahas, F.,… More

Pola-Silva, L., Xerfan Nahas, F., Nascimento, F., Santos, T. R., Malinverni, A. M., Alves, A., Ferreira, L. M., Melaragno, M. I. Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation. J. Vis. Exp. (178), e63036, doi:10.3791/63036 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter