Summary
目前的方案提出了一种快速、高效和温和的方法，用于从持续生长的小鼠门牙、小鼠臼齿和人类牙齿中分离出适合单细胞RNA-seq分析的单细胞。
Abstract
小鼠和人类牙齿代表着具有挑战性的器官，用于快速有效地分离单细胞转录组或其他应用。富含细胞外基质的牙髓组织需要漫长而繁琐的解离过程，通常超出了单细胞转录组学的合理时间。为了避免基因表达的人工变化，需要最小化从安乐死动物到分析单个细胞所经过的时间。这项工作提出了一种快速方案，能够以适合scRNA-seq（单细胞RNA测序）的优异质量从小鼠和人类牙齿中获得单细胞悬浮液。该协议基于加速的组织分离步骤，酶消化和随后制备最终的单细胞悬浮液。这样可以快速，温和地处理组织，并允许使用更多的动物或人类样品来获得具有高活力和最小转录变化的细胞悬浮液。预计该协议可能会指导有兴趣不仅在小鼠或人类牙齿上进行scRNA-seq的研究人员，而且在其他细胞外富含基质的组织（包括软骨，致密结缔组织和真皮）上进行scRNA-seq。
Introduction
单细胞RNA测序是破译 体内 细胞群结构、层次结构、相互作用和稳态的强大工具1，2。然而，其结果在很大程度上取决于这种高级分析的第一步 - 从复杂，组织良好的组织中制备出质量完美的单细胞悬浮液。这包括保持细胞存活并防止细胞基因表达谱中不必要的人为变化3，4。这种变化可能导致对人口结构的不准确描述和对所收集数据的误解。
已经开发了从各种组织中分离出的特定方案5，6，7，8。它们通常采用机械解离，并结合各种蛋白水解酶的进一步孵育。这些通常包括胰蛋白酶，胶原酶，解离，木瓜蛋白酶6，7，8，9或市售的酶混合物，如Accutase，Tryple等。影响转录组质量的最关键部分是酶消化。结果表明，在37°C下与酶长时间孵育会影响基因表达并导致许多应激相关基因的上调10，11，12，13。分离过程的另一个关键参数是其总长度，因为已经表明细胞转录组在组织缺血后会发生变化14。该方案为从小鼠和人牙齿中温和分离单个细胞提供了一种有效的方案，比以前使用的其他从复杂组织中分离细胞的方案更快5，6，9，11，13，15，16。
该协议介绍了如何从硬牙中快速解剖软组织并制备适合scRNA-seq的单细胞悬浮液。该方法仅采用一个离心步骤，并通过减少组织处理和消化时间以及将组织和细胞大部分时间保持在4°C来最小化不需要的转录变化的影响。该程序展示了从小鼠门牙，臼齿和人类智齿中分离细胞作为示例，但主要应该适用于各种生物体中的其他牙齿。完整的协议如图 1 所示。该协议最近已被用于生成从小鼠和人类牙齿获得的牙科细胞类型图谱1。
Protocol
所有动物实验均根据国际和地方法规进行，并得到捷克共和国教育，青年和体育部的批准（MSMT-8360 / 2019-2;MSMT-9231/2020-2;MSMT-272/2020-3）。该协议在C57BL / 6背景上用雄性和雌性野生型C57BL / 6和CD-1小鼠以及转基因Sox10：：iCreERT2小鼠17（与各种报告系统相结合）进行测试。 在捷克共和国布尔诺的马萨里克大学布尔诺和圣安妮学院医院医学院伦理委员会的批准下，对人体样本进行了实验。
1. 实验设置和溶液制备
- 仪器设置
- 将离心机冷却至4°C。
- 将培养箱加热至37°C。
- 启动荧光激活细胞分选（FACS）机器，并将分选机（包括收集管支架）的所有温度设置为4°C。 执行仪器质量控制，设置跌落延迟。
- 设置初步门控策略并执行测试排序。
注意：使用 FACS 时，请使用 100 μm 喷嘴。
- 准备解决方案（步骤 1.2.1-1.2.3）。
- 洗涤液：在HBSS（汉克斯平衡盐溶液）中制备新鲜的2%FBS（胎牛血清）。
- 消化混合物：准备完全溶解在HBSS中的新鲜胶原酶P（3 U / mL）。
- 可选：制备新鲜的HBSS + BSA（0.04%），并将分析级甲醇冷却在-20°C冰箱中，以将单细胞悬浮液储存在-80°C。
注意：在实验开始之前需要执行步骤1。所用溶液的组成总结在 补充表1中。
2. 实验动物和人类牙齿的制备
- 准备实验动物（小鼠）。
- 根据当地法规对老鼠实施安乐死;例如，如前所述，通过麻醉剂过量1。
注意：对实验动物实施人道安乐死的规定因地而异。始终遵守有效的当地法规。 - 立即进行组织解剖步骤（步骤3）。
注意：如果实验动物的组织不能立即解剖（例如，由于从动物宿主设施转移），请将实验动物放在冰上并尽快进行组织解剖。为了从小鼠磨牙髓中获得更多的细胞，使用年轻（6周或更短）的动物。随着年龄的增长，牙髓的大小减小。小鼠门牙大多随着年龄的增长而保持其结构，因此不同年龄的动物可用于组织解剖。
- 根据当地法规对老鼠实施安乐死;例如，如前所述，通过麻醉剂过量1。
- 准备人的牙齿
注意：人类牙齿的拔牙是出于临床相关的原因。每个诊断都单独治疗，经验丰富的牙科医生总是进行拔牙。- 立即将刚拔出的牙齿放入装有冰冷HBSS的50 mL管中，并将管子保持在冰上，直到进一步处理。
注意：建议从患者到25-30岁使用保留的智齿，以获得最高的细胞产量。
- 立即将刚拔出的牙齿放入装有冰冷HBSS的50 mL管中，并将管子保持在冰上，直到进一步处理。
3. 组织解剖
- 将实验动物抱在脑后，观察其头部的腹侧，使尾巴指向远处。
- 使用小而锋利的剪刀，快速从下颌骨上取出皮肤，以暴露下颌弓，下颌骨每半部之间的软组织和相邻的面部肌肉。
- 从下颌骨的每一侧进行深切;首先，通过m. m. 咬肌沿着下颌骨的颊侧直到颞下颌关节，然后沿着下颌骨每半部分的内部通过口腔的底部（见 补充图1）。
- 从口腔内外切除沿下颌骨直至颞下颌关节的所有肌肉和韧带。
注意：避免割骨。这可能会损坏门牙最顶端的部分。 - 使用弯曲的尖端镊子抓住下颌骨并将其取下。然后，通过切开下颌骨联合，用剪刀将解剖的下颌骨分成两半（见 补充图1）。
- 使用工业低棉绒擦拭，擦拭下颌骨每半部分剩余的软组织。在下颌骨的两个部分都清洁后，将它们放入预先准备好的带有冰冷HBSS的培养皿中。
注意：从现在开始，在冰上工作。在具有黑色背景的立体显微镜下进一步解剖小鼠门牙和臼齿。 - 小鼠下颌门牙
- 对于下颌门牙的解剖，切除所有三颗臼齿的牙槽嵴，并在与第一磨牙和第二磨牙之间的位置相对应的位置横向裂开下颌弓。
注：使用11号锋利的手术刀刀片和镊子执行此步骤（见 材料表）。 - 小心地将门牙从牙槽的其余部分拉出。
注意：如果成功，提取的门牙将包含完整的顶端部分，包括具有完整颈袢的上皮组织。 - 如果需要，用镊子和手术刀去除仍然附着在门牙上的剩余骨头碎片。
- 将解剖的门牙放入新鲜、冰冷的 HBSS 中，并解剖感兴趣的组织：宫颈袢、牙髓或牙齿的其他部位。
- 将解剖的软组织放入10厘米培养皿中间的新鲜冰冷的HBSS液滴中。保持在冰上。
- 对于下颌门牙的解剖，切除所有三颗臼齿的牙槽嵴，并在与第一磨牙和第二磨牙之间的位置相对应的位置横向裂开下颌弓。
- 小鼠下颌臼齿
- 为了解剖下颌臼齿，使用手术刀刀片从下颌骨的其余部分完全移除牙槽嵴。
- 将解剖的肺泡嵴移入培养皿中新鲜冰冷的HBSS中，并小心地去除附着在根部的所有剩余肺泡骨碎片。
- 将没有肺泡骨的解剖臼齿放入新鲜、冰冷的 HBSS 中。要暴露牙髓，请开始使用细而锋利的尖端镊子从顶端去除部分牙本质，直到到达牙髓腔。
- 到达牙髓腔后，使用一对锋利的尖端镊子仔细解剖牙髓，并将牙髓的软组织放入一滴新鲜的冰冷的HBSS中，放在10厘米的培养皿中间，保持在冰上。
注意：由于小鼠磨牙髓非常小，因此请相应地调整立体显微镜上的放大倍率。
- 人牙
- 在冰冷的HBSS中再次清洗人体牙齿，以去除剩余的血液。
- 将牙齿放入三个厚壁无菌塑料袋中，并使用铸铁台式工程师虎钳使牙齿破裂。使用表面平坦的虎钳钳口，以避免穿透袋子。
- 慢慢拧紧虎钳，直到听到牙齿开裂的声音;将其从袋子中取出，放入培养皿中新鲜冰冷的 HBSS 中。
- 使用两把镊子，取出牙髓，将其从所有残留的硬组织中清除干净，然后将其放入一滴冰冷的HBSS中，放在冰上保存的10厘米培养皿中间。
注意：人体组织可能具有传染性。处理人体组织时，请使用防护设备，避免与组织直接接触。
4. 单细胞悬浮液的制备
- 准备一个15毫升的管子，其中2.5毫升由完全溶解在HBSS中的胶原酶P（3 U / mL）组成的消化混合物。将溶液放在冰上直到使用。
注意：始终使用新鲜制备的胶原酶P;不要冷冻等分试样。胶原酶P活性因批次而异。稀释前检查批次的活动。胶原酶P被钙激活，钙的量在冻干粉末中已经足够了。因此，没有必要用钙丰富酶混合物。胶原酶P不会被FBS灭活，但可以通过螯合剂（例如，乙二胺四乙酸-EDTA）灭活。通过稀释洗涤溶液中的胶原酶P（HBSS中的2%FBS）来确保停止解离过程。已经证明，添加FBS会增加细胞活力和分选后的最终细胞数量18。 - 使用10号圆形手术刀刀片，将所有方向的组织切成尽可能小的碎片。重新聚集液滴中间的组织块，并使用圆形（10号）手术刀刀片反复切割组织聚集体。重复此过程几次，直到材料充分切碎。
- 使用1 mL移液器吸头将切碎的组织块转移到准备好的消化混合物中。
注意：在同时处理大量动物的情况下，用胶原酶P将组织分成几个管子。每管的最大量是从大约10个小鼠门牙中获得的纸浆。在磨牙的情况下，纸浆要小得多，加工纸浆的数量可以充分增加。使用人体牙齿时，每管最多使用2-3个牙髓，具体取决于牙髓的大小。 - 将管子放入带有振荡器的37°C预热培养箱中。将振动台内的管子倾斜到60°的角度，并将速度设置为150-200 rpm，以确保管内恒定的悬浮运动。
- 用1 mL移液器吸头每3-4分钟剧烈研磨悬浮液以分解所有团块。
注意：随着时间的推移，团块会变得更小更软，直到它们几乎消失。 - 总共孵育15-20分钟。在孵育结束时，最后一次研磨，然后缓慢加入冰冷的洗涤溶液至最终体积为12mL。
- 通过使用50μm细胞过滤器过滤悬浮液来除去剩余的团块或钙化组织。
- 取10-20μL过滤的细胞悬浮液，并在离心过程中使用细胞计数室（血细胞计数器）计数细胞。在4°C下以300× g 离心5分钟。 使用10 mL血清学移液器除去上清液。
注意：如果细胞数量有限，无法在稀释的悬浮液中计数，请跳过细胞计数并使用所有细胞进行进一步处理。 - 可选：进行固定和储存21。
- 将沉淀（最多107 个细胞）重新悬浮在100 uL的HBSS + BSA（0.04%）中。
- 加入400μL冷冻甲醇并缓慢混合。
- 将细胞悬浮液在冰上孵育15分钟。
- 储存在-80°C直至加工（不超过1个月）。
- 将沉淀重悬于洗涤溶液中。目标是700-1200个细胞/ μL的洗涤溶液。
- 将管子放在冰上，直到进一步处理。
注意：如有必要，请在-80°C下进行固定和储存。 然而，建议立即处理用于scRNA-seq的细胞悬浮液。进一步的步骤将取决于单细胞RNA seq方案。当scRNA-seq方案使用微流体系统（一些sc-RNA-seq公司这样做）时，根据制造商的指南直接或在细胞分选后对细胞进行加载。 - 对于 FACS，请继续执行步骤 5。
5. 荧光激活细胞分选（FACS）
- 在分选之前，准备细胞分选仪器。
- 将整个系统冷却到4°C，执行仪器质量控制，设置跌落延迟和偏转板的电压。将收集管放入收集管支架中。
注意：为避免额外的离心步骤导致不可避免的细胞损失，将细胞与少量（25-50μL）的洗涤溶液一起分类到微管（1.5mL）中。
- 将整个系统冷却到4°C，执行仪器质量控制，设置跌落延迟和偏转板的电压。将收集管放入收集管支架中。
- 可选：在 FACS 之前进行活力染色。
- 在FACS之前将碘化丙啶加入细胞悬浮液中，最终浓度为0.5μg/ mL，并在4°C下孵育15分钟。
- 将样品装入细胞分选机。设置严格的门控策略以清除细胞碎片，双层和死细胞。将细胞分选到准备好的管或多孔板中。门控策略的示例如图 2 所示。
注意：为了最大限度地减少操作步骤并加速实验方案，建议应用严格的门控策略（ 如图2所示），而不是使用活性染色。为了将免疫细胞从分离的群体中分离出来，可以进行CD45抗体染色。为此，将细胞悬浮液重悬于100μL染色溶液（PBS + 2%FBS +抗CD45-APC偶联抗体1/100稀释液）中。在避光的冰上孵育15分钟，并直接进行FACS。
Representative Results
从一只6周龄C57BL / 6小鼠雄性的两个下颌门牙中对单细胞进行示例性分离。按照该协议，制备单细胞悬浮液，随后进行单细胞测序。使用FACS分析和分类制备的单细胞悬浮液（图2）。首先，应用FSC-A（前向散射，面积）和SSC-A（侧散射，面积）绘图，并使用适当的门控策略选择具有预期大小和粒度的群体来过滤我们的细胞碎片和细胞双联体或聚集体（图2A）。进一步使用该选定的总体（P1），占所有事件的38%，并应用FSC-A和FSC-H（前向散射，高度）参数以去除剩余的细胞二倍体（图2B）。没有细胞二倍体（P2）的群体计数95%的P1随后可用于scRNA-seq。或者，可以使用额外的门控来选择感兴趣的群体（例如，荧光蛋白的表达或活/死染色）。为了检查最终悬浮液中活/死细胞的数量，进行了PI（碘化丙啶）染色（图2C）。含有PI- （活）细胞的P3群体在母体P2群体中占98.4%，在总事件中占35.5%。滤出的死细胞（PI +）细胞总数为1887个。
在没有适合RNA-seq（P2）的活性染色的情况下获得的细胞的最终数量计数了来自两个小鼠门牙髓的118，199个细胞。这意味着来自一个下颌门牙的近60，000个活细胞的数量。
为了澄清最终单细胞悬浮液中免疫细胞的数量，使用了两种方法。首先，使用CD45抗体染色和随后的FACS分析。作为补充方法，分析了scRNA-seq数据中免疫细胞（CD45 +）的总数。FACS分析显示14.44%的CD45 +细胞（13.20%存活，1.24%死）（图3A）。对scRNA-seq数据的分析显示10.90%的CD45表达细胞（图3B）。scRNA-seq数据中CD45 +细胞的减少可能是由scRNA-seq分析过程中的额外阈值引起的。
这些关于小鼠门牙示例的代表性数据表明，给定的方案与严格的门控策略相结合，可以有效地从单个小鼠牙齿中获得大量细胞，而无需额外使用活力染色。免疫（CD45 +）细胞的比例很小（13.2%）。此外，先前已经表明，免疫细胞对于维持牙齿稳态至关重要，因此在FACS期间将它们从scRNA-seq分析中移除在某些应用中会适得其反。
图1：协议示意图。 不同的步骤，包括温度条件和预期时间，表示从小鼠和人类牙齿制备单细胞悬浮液。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：门控策略示例。 FSC-A和SSC-A门控用于产生P1门，以预期的大小和粒度反映细胞群，并过滤掉细胞和细胞外基质碎片以及大多数大型事件（A）。随后，在FSC-H和FCS-A图中绘制P1群体，滤除细胞二倍体（B）。然后通过碘化丙啶（C）分析该P2群体是否存在死细胞。每个门的事件/像元数以 （D） 表示。（FSC-A - 前向散射，面积;SSC-A - 侧散射，面积;FSC-H - 前向散射，高度;PI - 碘化丙啶）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：免疫细胞的定量。 通过对用抗CD45抗体染色的细胞进行FACS分析和使用碘化丙啶染色（A）的活/死分析来对免疫细胞进行定量。在scRNA-seq分析（B）期间对免疫细胞进行进一步定量。（CD45-APC - 抗CD45别癣菌蓝蛋白偶联抗体;PI - 碘化丙啶;t-SNE - t-分布式随机邻居嵌入）。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充图1：下颌骨解剖过程概述。 虚线表示建议的切工。TMJ - 颞下颌关节，M.咬肌 - 肌肉咬肌。 请点击此处下载此文件。
补充表1：研究中使用的溶液的组成。请点击此处下载此表格。
Discussion
在细胞或分子水平上研究牙齿和骨骼通常具有挑战性，因为形成这些组织的细胞被不同类型的硬基质包围19。在牙齿组织上进行单细胞RNA-seq的主要目标之一是需要快速获得感兴趣的细胞，并且其转录组没有任何人为的变化。为了实现这一目标，开发了一种适用于从小鼠和人类牙髓中分离细胞的高效方案，其允许快速生成用于所有转录组学应用的单细胞悬浮液。这是通过快速组织分离，最大限度地减少组织和细胞操作的步骤以及简化机械和酶消化来确保的。
该协议最关键的步骤是快速组织处理和足够的单细胞悬浮液制备8，9。手动方法用于获得牙髓，而无需使用牙钻或其他发热装置。过热可能导致热休克蛋白和其他基因的人工表达，最终导致分析的基因表达模式不能代表原始组织20。手动组织采集可能是一个具有挑战性的步骤，可能需要事先进行一些培训。然后将果肉切成小块并在37°C下酶消化。 除了15-20分钟的酶消化外，整个方案在4°C下进行。 组织处理，特别是酶消化被最小化到尽可能短的时间，因为在37°C下更长时间的孵育会导致基因表达模式的变化10。建议在酶消化前机械去除牙本质。牙本质和牙髓附着的牙本质含有大量的胶原蛋白，其过量存在可能会降低消化液的有效性。在从体内移除（或生物体死亡）后，显示细胞开始快速修改其基因表达模式12。因此，应尽快进行细胞分离和处理。目前的方案将处理时间从分离组织（安乐死动物）到制备单细胞悬浮液减少到35-45分钟。
该技术的一种替代修改是细胞保存以供以后使用。这是通过甲醇固定实现的。甲醇固定细胞悬浮液可在-80°C下储存长达1个月，如协议中所述21。然而，只要有可能，直接进行scRNA-seq，因为已经证明来自甲醇固定单细胞悬浮液的单细胞数据可能会受到应激相关基因表达增加和环境RNA22污染的影响。此步骤可能需要根据制造商的协议进行其他修改。
在首次应用此协议之前，建议执行几个验证步骤来测试该技术。根据我们的经验，我们建议测试协议的上述关键步骤。此外，我们建议测试胶原酶P溶液的有效性并测试组织解离步骤的处理。具体而言，在胶原酶P孵育开始后的前5分钟左右，组织碎片应聚集在一起。这是一种常见的情况。使用1 mL移液器每3-4分钟分解一次聚集体，并且随着时间的流逝，它们应该变小直到几乎看不见。
此外，建议在离心前和过滤前后在细胞计数室中进行细胞计数，以检测由于上清液去除次优而可能导致的细胞损失。如果需要纯化最终的单细胞悬浮液，可以使用FACS。细胞分选不仅可以去除碎屑或死细胞，而且重要的是能够用荧光标记的细胞富集最终悬浮液13，19。为了避免剪切应力或细胞分选机堵塞，使用宽喷嘴（85μm或100μm）。这将进一步提高分类细胞的活力。
这项技术是在小鼠和人类牙齿上设计和测试的。主要的限制因素是老年小鼠（臼齿）和人类牙齿的减少牙髓中的细胞数量很少。假设需要获得更多数量的细胞或从老年患者的牙齿中获取细胞。一种可能的解决方案是加工更多数量的牙齿，并将它们合并成一个批次，然后作为一个样品进行处理。
二十多年前，人类牙髓的活细胞首次使用胶原酶I和dispase23的酶混合物分离出来。从那时起，牙髓细胞的分离被广泛使用，并且已经使用了几种技术5，6，7，8。这里介绍的方法的关键意义在于调整所有分离步骤，使分离快速而温和，以确保scRNA-seq的最终细胞悬浮液的高质量。通过更长时间的酶孵育可以获得更高的细胞产量。该方案为从小鼠和人牙齿中快速获得适合单细胞RNA测序的单细胞提供了有效的解决方案。该技术有望广泛用于其他组织或生物体，只需稍作技术修改即可。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
J.K.得到了马萨里克大学资助机构（MUNI/H/1615/2018）以及MU医学院对初级研究员的资助。J.L.得到了马萨里克大学拨款机构（MUNI/IGA/1532/2020）的支持，并且是布尔诺博士人才奖学金获得者 - 由布尔诺市政府资助。T.B.得到了奥地利科学基金的支持（Lise Meitner赠款：M2688-B28）。我们感谢Lydie Izakovicova Holla和Veronika Kovar Matejova在获得人类牙齿方面的帮助。最后，我们感谢Radek Fedr和Karel Soucek在FACS分类方面提供的友好协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 0 (0), (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 - Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
