Summary
Den nåværende protokollen presenterer en rask, effektiv og skånsom metode for å isolere enkeltceller som er egnet for encellet RNA-seq-analyse fra et kontinuerlig voksende musesnitt, musemolar og menneskelige tenner.
Abstract
Mus og menneskelige tenner representerer utfordrende organer for rask og effektiv celleisolasjon for encellet transkripsjon eller andre applikasjoner. Tannmassevevet, rik på den ekstracellulære matrisen, krever en lang og kjedelig dissosiasjonsprosess som vanligvis er utenfor den rimelige tiden for encellet transkripsjon. For å unngå kunstige endringer i genuttrykk, gikk tiden fra euthanizing et dyr til analysen av enkeltceller må minimeres. Dette arbeidet presenterer en rask protokoll som gjør det mulig å oppnå encellet suspensjon fra mus og menneskelige tenner i en utmerket kvalitet egnet for scRNA-seq (encellet RNA-sekvensering). Denne protokollen er basert på akselererte vevsisolasjonstrinn, enzymatisk fordøyelse og etterfølgende forberedelse av endelig encellet suspensjon. Dette muliggjør rask og skånsom behandling av vev og gjør det mulig å bruke flere dyre- eller menneskelige prøver for å oppnå cellesuspensjoner med høy levedyktighet og minimale transkripsjonsendringer. Det forventes at denne protokollen kan veilede forskere som er interessert i å utføre scRNA-seq ikke bare på musen eller menneskelige tenner, men også på andre ekstracellulære matriserike vev, inkludert brusk, tett bindevev og dermis.
Introduction
Encellet RNA-sekvensering er et kraftig verktøy for dechiffrering av in vivo-cellepopulasjonsstruktur, hierarki, interaksjoner og homeostase1,2. Resultatene avhenger imidlertid sterkt av det første trinnet i denne avanserte analysen - utarbeidelsen av en encellet suspensjon av perfekt kvalitet ut av det komplekse, velorganiserte vevet. Dette omfatter å holde cellene i live og forhindre uønskede, kunstige endringer i genuttrykksprofiler i cellene3,4. Slike endringer kan føre til unøyaktig karakterisering av populasjonsstruktur og feiltolkning av de innsamlede dataene.
Spesifikke protokoller for isolasjon ut av et bredt spekter av vev er utviklet5,6,7,8. De bruker vanligvis mekanisk dissosiasjon i kombinasjon med videre inkubasjon med ulike proteolytiske enzymer. Disse inkluderer vanligvis trypsin, collagenases, dispases, papain6,7,8,9, eller kommersielt tilgjengelige enzymblandinger som Accutase, Tryple, etc.5. Den mest kritiske delen som påvirker transkripsjonskvaliteten er enzymatisk fordøyelse. Det ble vist at langvarig inkubasjon med enzymer ved 37 °C påvirker genuttrykket og forårsaker oppregulering av mange stressrelaterte gener10,11,12,13. Den andre kritiske parameteren i isolasjonsprosessen er dens totale lengde, da det har vist seg at celletranskripsjonsomer endres etter vevets iskemi14. Denne protokollen presenterer en effektiv protokoll for skånsom isolasjon av enkeltceller fra mus og menneskelige tenner, raskere enn andre, tidligere benyttet protokoller for isolering av celler fra komplekse vev5,6,9,11,13,15,16.
Denne protokollen presenterer hvordan du raskt dissekerer bløtvev fra den harde tannen og forbereder en encellet suspensjon egnet for scRNA-seq. Denne metoden bruker bare ett sentrifugeringstrinn og minimerer effekten av uønskede transkripsjonsendringer ved å redusere vevshåndterings- og fordøyelsestiden og holde vevet og cellene ved 4 °C mesteparten av tiden. Prosedyren viser isolasjon av celler fra muse snitt, molar og menneskelig visdom tenner som et eksempel, men hovedsakelig bør fungere for andre tenner i ulike organismer. Hele protokollen visualiseres skjematisk i figur 1. Denne protokollen har nylig blitt brukt til å generere et tanncelletypeatlas hentet fra mus og menneskelige tenner1.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til internasjonale og lokale forskrifter og godkjent av Kunnskapsdepartementet, ungdom og idrett, Tsjekkia (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Denne protokollen ble testet med både mannlige og kvinnelige wildtype C57BL/6- og CD-1-mus og med genetisk modifiserte Sox10::iCreERT2-mus17 (kombinert med ulike reportersystemer) på C57BL/6-bakgrunn. Eksperimenter med menneskelige prøver ble utført med godkjenning av komiteene for etikk ved det medisinske fakultetet, Masaryk University Brno &St. Anne's Faculty Hospital i Brno, Tsjekkia.
1. Eksperimentelt oppsett og utarbeidelse av løsninger
- Oppsett av instrumenter
- Avkjøl sentrifugen til 4 °C.
- Varm inkubasjonskammeret til 37 °C.
- Start den Fluorescensaktiverte cellesorteringsmaskinen (FACS) og sett alle temperaturene på sorteringsmaskinen (inkludert oppsamlingsrørholder) til 4 °C. Utfør instrumentets kvalitetskontroll, still inn fallforsinkelsen.
- Angi den foreløpige gatingstrategien, og utfør testsorteringen.
MERK: Når du bruker FACS, bruk 100 μm-dysen.
- Klargjør løsningene (trinn 1.2.1-1.2.3).
- Vaskeløsning: Forbered fersk 2% FBS (Fetal Bovine Serum) i HBSS (Hanks' balansert saltløsning).
- Fordøyelsesblanding: Tilbered fersk kollagenalise P (3 U/ml) helt oppløst i HBSS.
- Valgfritt: Forbered fersk HBSS + BSA (0,04%) og chill analytisk grad metanol i en -20 °C fryser for lagring av encellet suspensjon ved -80 °C.
MERK: Trinn 1 må utføres før eksperimentet starter. Sammensetningen av de benyttede løsningene er oppsummert i supplerende tabell 1.
2. Utarbeidelse av forsøksdyr og menneskelig tann
- Forbered de eksperimentelle dyrene (mus).
- Euthanize musen i henhold til lokale forskrifter; f.eks. ved anestesioverdose som beskrevet tidligere1.
FORSIKTIG: Regelverket for human euthanizing av eksperimentelle dyr varierer lokalt. Følg alltid gyldige lokale forskrifter. - Fortsett umiddelbart til vevsreksjonstrinnet (trinn 3).
MERK: Hvis vevet fra de eksperimentelle dyrene ikke kan dissekeres umiddelbart (f.eks. på grunn av overføring fra dyrehusanlegg), plasser de eksperimentelle dyrene på is og utfør vevspredning så snart som mulig. For å få flere celler fra mus molar masser, bruk yngre (6 uker og mindre) dyr. Med økende alder reduseres størrelsen på tannmassen. Museinnsnitt holder for det meste sin struktur med økende alder, slik at dyr i ulike aldre kan brukes til vevspredning.
- Euthanize musen i henhold til lokale forskrifter; f.eks. ved anestesioverdose som beskrevet tidligere1.
- Forbered den menneskelige tannen
MERK: Menneskelige tenner ble ekstrahert av klinisk relevant grunn. Hver diagnose ble behandlet individuelt, og en erfaren tannkirurg utførte alltid tannutvinningen.- Legg den nyutpakkede tannen umiddelbart i et 50 ml rør med iskald HBSS og hold røret på is til videre behandling.
MERK: Bruk av beholdte visdomstenner fra pasienter til fylte 25-30 år anbefales for det høyeste celleutbyttet.
- Legg den nyutpakkede tannen umiddelbart i et 50 ml rør med iskald HBSS og hold røret på is til videre behandling.
3. Vev disseksjon
- Hold det eksperimentelle dyret bak hodet, og se på det ventrale aspektet av hodet slik at halen peker bort.
- Bruk liten, skarp saks, fjern raskt huden fra mandibelen for å avsløre mandibulærbuen, det myke vevet mellom hver halvdel av mandiblene og de tilstøtende ansiktsmusklene.
- Lag et dypt kutt fra hver side av mandibelen; for det første, gjennom m. massør langs bukkal side av mandibelen opp til det temporomandibulære leddet, og deretter langs den indre delen av hver halvdel av mandibelen gjennom bunnen av munnhulen (se supplerende figur 1).
- Klipp alle muskler og leddbånd langs mandibelen opp til temporomandibulærleddet fra både utsiden og innsiden av munnhulen.
MERK: Unngå å skjære bein. Dette kan skade den mest apikale delen av snittet. - Ta tak i mandibelen ved hjelp av bøyde tweezers og fjern den. Deretter deler du den dissekerte mandibelen i to halvdeler med saks ved å skjære gjennom mandibulær symfyse (se supplerende figur 1).
- Bruk en industriell lav loserviett for å gnage det gjenværende bløtvevet fra hver halvdel av mandibelen. Etter at begge delene av mandibelen er rengjort, legg dem i en ferdiglaget Petri-tallerken med iskald HBSS.
MERK: Fra dette punktet og fremover, arbeid på is. Videre disseksjon av muse snitt og molarer utføres under et stereomikroskop med svart bakgrunn. - Mandibulære mus snitt
- For disseksjon av mandibulære snitt, fjern alveolarryggen med alle tre molarene og sprekk den mandibulære buen på stedet som tilsvarer posisjonen mellom første og andre molar.
MERK: En skarp skalpellblad nr. - Trekk snittet forsiktig ut av resten av tannkontakten.
MERK: Hvis det lykkes, vil det ekstraherte snittet inneholde intakte apikale deler, inkludert epitelvev med komplette livmorhalsløkker. - Om nødvendig, fjern de resterende fragmentene av bein som fortsatt er festet til snittet med pinsett og en skalpell.
- Plasser de dissekerte snittene i frisk, iskald HBSS og disseker vevet av interesse: cervical loop, tannmasse eller andre deler av tannen.
- Legg det dissekerte bløtvevet i en dråpe frisk, iskald HBSS midt på en 10 cm Petri-tallerken. Hold deg på isen.
- For disseksjon av mandibulære snitt, fjern alveolarryggen med alle tre molarene og sprekk den mandibulære buen på stedet som tilsvarer posisjonen mellom første og andre molar.
- Mus mandibulære molarer
- For dissekering av mandibulære molarer, fjern alveolarryggen helt fra resten av mandibelen ved hjelp av et skalpellblad.
- Flytt den dissekerte alveolarkampen inn i frisk, iskald HBSS i en Petri-tallerken og fjern forsiktig alle gjenværende fragmenter av alveolarben festet til røttene.
- Plasser de dissekerte molarene uten alveolarben i frisk, iskald HBSS. For å eksponere massen, begynn å fjerne deler av dentin fra den apikale siden ved hjelp av fine, skarpe spiss pinsett til du kommer til massehulen.
- Når massehulen er nådd, dissekerer du forsiktig tannmassen ved hjelp av et par skarpe tweezers og legger tannmassens myke vev i en dråpe fersk, iskald HBSS midt i en 10 cm Petri-tallerken holdt på is.
MERK: Siden musens molarmasser er ekstremt små, tilpasser du forstørrelsen på stereomikroskopet tilsvarende.
- Menneskelig tann
- Vask menneskelig tann igjen i iskald HBSS for å fjerne det gjenværende blodet.
- Legg tannen i tre sterile plastposer med tykk vegg og bruk en støpejernsbenkingeniørs skrustikke til å knekke tannen. Bruk skrustikkekjever med en flat overflate for å unngå å trenge inn i posene.
- Stram skrustikken langsomt til du hører tannen sprekke; fjern den fra posene og legg den i frisk, iskald HBSS i en Petri-tallerken.
- Bruk to pinsett, ta ut tannmassen, rengjør den fra alle rester av hardt vev og legg den i en dråpe iskald HBSS midt i en 10 cm Petri-tallerken holdt på is.
FORSIKTIG: Humant vev kan potensielt være smittsomt. Når du arbeider med menneskelig vev, bruk verneutstyr for å unngå direkte kontakt med vevet.
4. Fremstilling av encellet suspensjon
- Forbered et 15 ml rør med 2,5 ml fordøyelsesblanding sammensatt av Kollagenalisse P (3 U/ml) helt oppløst i HBSS. Hold oppløsningen på is til bruk.
MERK: Bruk alltid nylaget kollagenalise P; Ikke frys aliquots. Collagenase P-aktiviteten varierer fra parti til parti. Kontroller aktiviteten til batchen din før du fortynner. Collagenase P aktiveres av kalsium, hvis mengde allerede er tilstrekkelig i det lyofiliserte pulveret. Derfor er det unødvendig å berike enzymblandingen med kalsium. Kollagenase P er ikke inaktivert av FBS, men kan inaktiveres av chelateringsmidler (f.eks. etylendiamintetraacetic - EDTA). Stopp av dissosiasjonsprosessen sikres ved å fortynne Collagenase P i vaskeoppløsning (2% FBS i HBSS). Det har vist seg at å legge til FBS øker celle levedyktigheten og det endelige antall celler etter sortering18. - Bruk et rundformet skalpellblad nr. Aggreger vevsstykkene midt på dråpen og klipp vevsaggregatene gjentatte ganger ved hjelp av et rundformet (nr. 10) skalpellblad. Gjenta denne prosessen flere ganger til materialet er tilstrekkelig hakket.
- Overfør de ristede vevsstykkene ved hjelp av en 1 ml pipettespiss til den tilberedte fordøyelsesblandingen.
MERK: Ved et større antall dyr som behandles samtidig, del vevet i flere rør med Collagenase P. Maksimal mengde per rør er masser hentet fra ca. 10 muse snitt. Når det gjelder molarer, hvor massene er mye mindre, kan antall bearbeidede masser økes tilstrekkelig. Når du bruker menneskelige tenner, bruk maksimalt 2-3 masser per rør, avhengig av massestørrelsen. - Plasser røret i en 37 °C forvarmet inkubator med en shaker. Vipp røret inne i shakeren i en vinkel på 60° og sett hastigheten til 150-200 rpm for å sikre konstante fjæringsbevegelser inne i røret.
- Trianturer suspensjonen kraftig hver 3-4 min med en 1 ml pipettespiss for å oppløse alle klumpene.
MERK: Med tiden blir klumpene mindre og mykere til de nesten forsvinner. - Totalt inkuberer du i 15-20 min. På slutten av inkubasjonen, trianturer for siste gang, og tilsett deretter sakte iskald vaskløsning til et sluttvolum på 12 ml.
- Fjern de resterende klumpene eller delene av forkalket vev ved å filtrere suspensjonen ved hjelp av en 50 μm cellesil.
- Ta 10-20 μL av den filtrerte cellefjæringen og tell cellene under sentrifugering ved hjelp av et celletellingskammer (Hemocytometer). Sentrifuge i 5 min ved 300 x g ved 4 °C. Fjern supernatanten ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.
MERK: Hvis antall celler er begrenset som ikke kan telles i fortynnet suspensjon, hopp over celletellingen og bruk alle cellene til videre behandling. - Valgfritt: Fortsett med fiksering og lagring21.
- Re-suspendere pellets (opptil 107 celler) i 100 uL HBSS + BSA (0,04%).
- Tilsett 400 μL kjølt metanol og bland sakte.
- Inkuber cellefjæringen i 15 min på is.
- Oppbevares ved -80 °C til den behandles (ikke lenger enn 1 måned).
- Resuspend pelletsen i vaskeoppløsningen. Sikt på 700-1200 celler / μL av vaskeløsningen.
- Hold røret på is inntil videre bearbeiding.
MERK: Utfør om nødvendig fiksering og oppbevaring ved -80 °C. Imidlertid anbefales umiddelbar behandling av cellefjæringen for scRNA-seq. Ytterligere trinn vil avhenge av encellet RNA seq-protokoll. Når scRNA-seq-protokollen bruker et mikrofluidisk system (noen sc-RNA-seq selskaper gjør), last cellene basert på produsentens retningslinjer enten direkte eller etter cellesortering. - For aktiva fortsetter du til trinn 5.
5. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS)
- Før du sorterer, klargjør du cellesorteringsinstrumentet.
- Avkjøl hele systemet til 4 °C, utfør instrumentets kvalitetskontroll, still inn fallforsinkelsen og spenningen på avbøyningsplatene. Sett oppsamlingsrør i oppsamlingsrørholderen.
MERK: For å unngå ytterligere sentrifugeringstrinn som resulterer i et uunngåelig celletap, kan du sortere celler i et mikrorør (1,5 ml) med en liten mengde (25-50 μL) av vaskeløsningen.
- Avkjøl hele systemet til 4 °C, utfør instrumentets kvalitetskontroll, still inn fallforsinkelsen og spenningen på avbøyningsplatene. Sett oppsamlingsrør i oppsamlingsrørholderen.
- Valgfritt: Utfør levedyktighetsfarging før FACS.
- Tilsett Propidiumjodid i cellefjæring før FACS til en endelig konsentrasjon 0,5 μg/ml og inkuber i 15 minutter ved 4 °C.
- Last inn eksemplet i cellesorteringen. Sett en streng gatingstrategi for å fjerne cellerester, dobler og døde celler. Sorter cellene i et forberedt rør eller flerbrønnplater. Et eksempel på en gatingstrategi vises i figur 2.
MERK: For å minimere manipulasjonstrinn og akselerere protokollen, anbefales det å bruke en streng gatingstrategi (foreslått i figur 2) i stedet for å bruke en levedyktighetsfarging. For å skille immuncellene fra den isolerte populasjonen, kan CD45 antistofffarging utføres. For å utføre dette, resuspend celle suspensjon i 100 μL av farging løsning (PBS + 2% FBS + anti-CD45-APC konjugert antistoff 1/100 fortynning). Inkuber i 15 min på is beskyttet mot lys og utfør FACS direkte.
Representative Results
Eksemplarisk isolasjon av enkeltceller ble utført fra to mandibulære snitt fra en 6 uker gammel C57BL / 6 mushann. Etter denne protokollen ble det utarbeidet en encellet suspensjon, og deretter ble det utført encellet sekvensering. Den forberedte encellede suspensjonen ble analysert og sortert ved hjelp av FACS (figur 2). For det første ble FSC-A -plottingen (fremoverspredning, areal) og SSC-A-plotting (sidespredning, areal) brukt, og en passende gatingstrategi ble brukt til å velge en populasjon med forventet størrelse og detaljnivå for å filtrere celleavfall og celledobbel eller aggregater (figur 2A). Denne valgte populasjonen (P1), som teller 38 % av alle hendelser, ble videre brukt, og parameterne FSC-A og FSC-H (fremoverspredning, høyde) ble brukt til å fjerne de gjenværende celledobbelene (figur 2B). Populasjonen uten celledobbel (P2) som teller 95% av P1 kan senere brukes til scRNA-seq. Alternativt kan ytterligere gating brukes til å velge interessepopulasjonen (f.eks. uttrykk for fluorescerende proteiner eller levende / død farging). For å kontrollere antall levende/døde celler i den endelige suspensjonen, ble PI (propidiumjodid) farging utført (figur 2C). P3-populasjonen som inneholdt PI- (levende) celler var 98,4% av den overordnede P2-populasjonen og 35,5% av de totale hendelsene. Totalt antall filtrerte, døde celler (PI+) var 1887.
Det endelige antallet celler oppnådd uten levedyktighetsfarging egnet for RNA-seq (P2) telte 118 199 celler fra to musesnittmasser. Dette betyr antall nesten 60.000 levende celler fra ett mandibulært snitt.
For å avklare antall immunceller i den endelige encellede suspensjonen, ble to tilnærminger brukt. For det første ble CD45 antistofffarging og påfølgende FACS-analyse brukt. Som en komplementær metode ble det totale antallet immunceller (CD45+) i scRNA-seq-data analysert. FACS-analysen viste 14,44 % av CD45+-cellene (13,20 % levende og 1,24 % døde) (figur 3A). Analyse av scRNA-seq-data viste 10,90 % av CD45-uttrykkende celler (figur 3B). Reduksjonen av CD45+-celler i scRNA-seq-data kan skyldes ytterligere terskler under scRNA-seq-analyse.
Disse representative dataene om eksempelet på museinnsnitt viser at den gitte protokollen i kombinasjon med streng gatingstrategi er effektiv for å skaffe et høyt antall celler ut av en enkelt musetann uten nødvendigheten av ytterligere bruk av levedyktighetsfarging. Forholdet mellom immunceller (CD45+) var mindre (13,2 %). Videre ble det tidligere vist at immuncellene er avgjørende for å opprettholde tann homeostase, så å fjerne dem fra scRNA-seq analyse under FACS ville være kontraproduktivt i noen applikasjoner.
Figur 1: Skjematisk representasjon av protokollen. Ulike trinn, inkludert temperaturforhold og forventet tid, er representert for å forberede encellet suspensjon fra mus og menneskelige tenner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på gating-strategien. FSC-A og SSC-A gating ble brukt til å produsere P1 gate, reflektere cellepopulasjonen med forventet størrelse og granularitet og filtrere ut cellen og ekstracellulær matrise rusk og de fleste store hendelser (A). Deretter ble P1-befolkningen plottet inn i FSC-H og FCS-A-plottet, som filtrerte ut celledobbeler (B). Denne P2-populasjonen ble deretter analysert for tilstedeværelse av døde celler ved propidiumjodid (C). Antall hendelser/celler per port er representert i (D). (FSC-A - fremoverspredning, areal; SSC-A - sidespredning, område; FSC-H - fremoverspredning, høyde; PI - propidiumjodid). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av immuncellene. Kvantifisering av immuncellene ble utført ved FACS-analyse av celler farget med anti-CD45 antistoff og Live / Dead analyse ved hjelp av propidiumjodidfarging (A). Ytterligere kvantifisering av immunceller ble utført under scRNA-seq analyse (B). (CD45-APC - anti-CD45 allophycocyanin konjugert antistoff; PI - propidiumjodid; t-SNE - t-distribuert stokastisk naboinnbygging). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Oversikt over den mandible disseksjonsprosessen. Stiplede linjer illustrerer foreslåtte kutt. TMJ - temporomandibulær ledd, m. massør - musculus massør. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Sammensetningene av løsningene som brukes i studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Å studere tenner og bein på cellulært eller molekylært nivå er generelt utfordrende siden celler som danner disse vevene er omgitt av forskjellige typer harde matriser19. Et av hovedmålene for å utføre encellet RNA-seq på tannvev er behovet for å skaffe celler av interesse raskt og uten kunstige endringer i transkripsjonen. For å oppnå dette ble det utviklet en svært effektiv protokoll som er egnet for å isolere celler fra mus og menneskelige tannmasser, noe som muliggjør rask generering av encellede suspensjoner for alle transkripsjonsapplikasjoner. Dette ble sikret ved rask vevsisolasjon, minimere trinnene i vev og cellemanipulasjoner, og effektivisere den mekaniske og enzymatiske fordøyelsen.
De mest kritiske trinnene i denne protokollen er rask vevsbehandling og tilstrekkelig enkeltcellet suspensjonspreparering8,9. En manuell tilnærming brukes til å skaffe tannmasser uten å bruke en tannbor eller andre varmegenererende enheter. Overoppheting kan forårsake et kunstig uttrykk for varmesjokkproteiner og andre gener, noe som til slutt fører til at de analyserte genuttrykksmønstrene er upretensiøse av det opprinnelige vevet20. Manuell vevshøsting kan være et utfordrende skritt som sannsynligvis vil trenge litt trening på forhånd. Massen kuttes deretter i små biter og fordøyes enzymatisk ved 37 °C. Bortsett fra 15-20 min enzymatisk fordøyelse, utføres hele protokollen ved 4 °C. Vevsbehandlingen og spesielt den enzymatiske fordøyelsen ble minimert til kortest mulig tid siden mer langvarig inkubasjon ved 37 °C kan forårsake endringer i genuttrykksmønstre10. Mekanisk fjerning av dentin anbefales før enzymatisk fordøyelse. Dentin og den pulp-vedlagte predentin inneholder en stor mengde kollagen, og overdreven tilstedeværelse kan redusere effektiviteten av fordøyelsesløsningen. Etter å ha blitt fjernet fra kroppen (eller død av organismer), ble det vist at celler begynner å endre sine genuttrykksmønstre raskt12. Derfor bør celleisolasjon og behandling utføres så raskt som mulig. Den nåværende protokollen reduserer behandlingstiden til 35-45 min fra å isolere vevet (euthanizing dyr) til å forberede encellet suspensjon.
En alternativ modifikasjon av denne teknikken er cellebevaring for senere bruk. Dette oppnås ved metanolfiksering. Metanol-fast celle suspensjon kan lagres i opptil 1 måned ved -80 °C, som beskrevet i protokollen21. Men når det er mulig, utfør scRNA-seq direkte, siden det ble vist at encellede data fra metanolfaste encellede suspensjoner kan lide av økt uttrykk for stressrelaterte gener og forurensning med omgivende RNA22. Dette trinnet kan trenge ytterligere endring i henhold til produsentens protokoller.
Før den første applikasjon av denne protokollen, anbefales det å utføre flere valideringstrinn for å teste teknikken. Fra vår erfaring foreslår vi å teste de nevnte kritiske trinnene i protokollen. I tillegg foreslår vi å teste effektiviteten av kollagenalisse P-løsningen og teste håndteringen av vevsdissosiasjonstrinnet. Spesielt rundt de første 5 min etter initiering av kollagenalisse P-inkubasjon, bør vevsstykkene samles sammen. Dette er en vanlig situasjon. Aggregater oppløses hvert 3-4 min ved hjelp av en 1 ml pipette, og med økende tid bør de bli mindre til de knapt er synlige.
Videre anbefales det å utføre celletelling i et celletellingskammer før sentrifugering og før og etter filtrering for å oppdage mulige celletap på grunn av suboptimal supernatant fjerning. Hvis den endelige encellede suspensjonen må renses, kan FACS brukes. Cellesortering gjør det mulig å fjerne rusk eller døde celler, men gjør det viktig å berike endelig suspensjon med fluorescerende merkede celler13,19. For å unngå skjærspenning eller tilstopping av cellesorteringen, brukes en bred dyse (85 μm eller 100 μm). Dette vil ytterligere forbedre levedyktigheten til de sorterte cellene.
Denne teknikken ble designet og testet på både mus og menneskelige tenner. Den viktigste begrensende faktoren er det lille antallet celler i de reduserte tannmassene til tennene til eldre mus (molarer) og mennesker. Anta at et større antall celler må oppnås eller celler fra tennene til eldre pasienter skal anskaffes. En mulig løsning er å behandle et høyere antall tenner og slå dem sammen til en enkelt batch, deretter behandlet som en prøve.
Levende celler av menneskelig tannmasse ble først isolert for mer enn tjue år siden ved hjelp av en enzymblanding av kollagenase I og dispase23. Siden da har isolasjoner av tannmasseceller blitt mye brukt, og flere teknikker har blitt brukt5,6,7,8. Den kritiske betydningen av metoden som presenteres her er tilpasningen av alle isolasjonstrinn for å gjøre isolasjonen rask og skånsom for å sikre den høye kvaliteten på den endelige cellefjæringen for scRNA-seq. Høyere celleutbytte kan oppnås ved mer langvarig inkubasjon med enzymer. Denne protokollen gir en effektiv løsning for raskt å skaffe enkeltceller fra mus og menneskelige tenner av passende kvalitet for encellet RNA-sekvensering. Denne teknikken forventes å bli mye brukt til andre vev eller organismer med bare små tekniske modifikasjoner.
Disclosures
Forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
J.K. ble støttet av Grant Agency of Masaryk University (MUNI/H/1615/2018) og av midler fra Det medisinske fakultet MU til juniorforsker. J.L. ble støttet av Grant Agency of Masaryk University, (MUNI/IGA/1532/2020) og er en Brno Ph.D. Talent Scholarship Holder - Finansiert av Brno City Municipality. T.B. ble støttet av Det østerrikske vitenskapsfondet (Lise Meitner grant: M2688-B28). Vi takker Lydie Izakovicova Holla og Veronika Kovar Matejova for deres hjelp med å skaffe menneskelige tenner. Til slutt takker vi Radek Fedr og Karel Soucek for deres vennlige hjelp med FACS-sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 0 (0), (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 - Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
