Здесь мы описываем и демонстрируем протокол первичной изоляции синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши (LSEC). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени, непаренхимальной очистке клеток низкоскоростной центрифугированием и выборе магнитных шариков CD146. Мы также фенотипируем и характеризуем эти изолированные ЛСЭК с помощью проточной цитометрии и сканирующей электронной микроскопии.
Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) представляют собой специализированные эндотелиальные клетки, расположенные на границе между кровообращением и паренхимой печени. ЛСЭС имеют отчетливую морфологию, характеризующуюся наличием фенестрат и отсутствием базальной мембраны. ЛСЭС играют важную роль во многих патологических расстройствах печени, включая метаболическую дисрегуляцию, воспаление, фиброз, ангиогенез и канцерогенез. Тем не менее, мало что было опубликовано об изоляции и характеристике LSEC. Здесь в этом протоколе обсуждается изоляция LSEC как от здоровых, так и от неалкогольных мышей с жировой болезнью печени (НАЖБП). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и магнитном отборе непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. Это исследование характеризует ЛСЭС с использованием специфических маркеров с помощью проточной цитометрии и идентифицирует характерные фенотипические особенности с помощью сканирующей электронной микроскопии. ЛСЭС, выделенные в соответствии с этим протоколом, могут использоваться для функциональных исследований, включая анализы адгезии и проницаемости, а также для последующих исследований для конкретного пути, представляющего интерес. Кроме того, эти ЛСЭС могут быть объединены или использованы по отдельности, что позволяет генерировать мультиомные данные, включая объемную или одноклеточную РНК-seq, протеомную или фосфопротеомику и анализ на транспозазно-доступный хроматин с использованием секвенирования (ATAC-seq), среди прочих. Этот протокол будет полезен для исследователей, изучающих связь LSECs с другими клетками печени в области здоровья и болезни, и позволит глубоко понять роль LSECs в патогенных механизмах острого и хронического повреждения печени.
Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) выстилают стенки синусоиды печени и являются наиболее распространенными непаренхимальными клетками в печени1. ЛСЭС отличаются от других капиллярных эндотелиальных клеток в других частях тела наличием фенестр и отсутствием классической базальной мембраны или диафрагмы 2,3. Следовательно, ЛСЭС обладают отличительными фенотипическими и структурными характеристиками, которые повышают их проницаемость и эндоцитарную способность устранять различные циркулирующие макромолекулы, включая липиды и липопротеины. LSECs играют ключевую роль в перекрестных помехах между паренхиматозными и непаренхимальными клетками, такими как звездчатые клетки и иммунные клетки. ЛСЭС играют ключевую роль в поддержании гомеостаза печени, сохраняя звездчатые клетки и клетки Купфера в состоянии покоя4. ЛСЭС модулируют состав популяций печеночных иммунных клеток, опосредуя адгезию и трансэндотелиальную миграцию циркулирующих лейкоцитов 5,6. Во время острого и хронического повреждения печени7, включая ишемию-реперфузионное повреждение (IRI)8, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)9 и гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК), ЛСЭС подвергаются фенотипическим изменениям, известным как капилляризация, характеризующаяся дефенестрацией и образованием базальной мембраны10. Эти фенотипические изменения в ЛСЭС связаны с дисфункцией ЛСЭС и приобретением протромботических, провоспалительных и профиброгенных свойств.
Было разработано несколько методов выделения ЛСЭС из печени мышей11. Некоторые методы зависят от разделения непаренхимальных и паренхиматозных клеток с последующим центрифугированием градиента плотности для очистки LSECs от непаренхимальных фракций. Ограничением этого метода является наличие загрязняющих макрофагов на заключительных этапах выделения ЛСЭС, что может повлиять на чистоту изолированных ЛСЭС12. Этот протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и положительном отборе магнитных шариков CD146+ непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. ЛСЭС, выделенные с помощью этого метода, демонстрируют высокую чистоту и сохраненную морфологию и жизнеспособность. Эти ЛСЭС являются оптимальными для функциональных исследований, включая анализ проницаемости и адгезии, а также для последующих исследований интересующих путей. Кроме того, с растущим интересом к созданию больших наборов данных как в клинических исследованиях, так и в науке об открытиях, эти высококачественные ЛСЭС, выделенные как из здоровой, так и из больной печени с неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ) или другими состояниями, могут объединяться или использоваться индивидуально, что позволяет генерировать мультиомические данные и сравнивать здоровье и заболевание13,14 . Кроме того, изолированные ЛСЭС могут быть использованы для разработки двумерных, а также трехмерных моделей in vitro, таких как органоиды, для расшифровки активированного сигнального пути в ЛСЭС и их межклеточной связи с другими клетками печени при различных вредных стимулах и в ответ на различные терапевтические вмешательства.
В текущей рукописи мы описываем протокол изоляции LSEC из печени мыши, состоящий из двухступенчатой перфузии коллагеназы и последующей магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Этот протокол состоит из следующих трех этапов: (1) перфузия через PV с буфером без кальция с последующим б…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек NIH (1RO1DK122948 to SHI) и NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Поддержку КФ оказывали также зарубежные исследовательские стипендии Японского общества содействия развитию науки (JSPS). Мы также хотели бы поблагодарить доктора Грегори Горса и Стивена Бронка за их оригинальный дизайн и оптимизацию аппарата перфузии коллагеназы.
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |