Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris
Summary
Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.
Abstract
Les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (CSL) sont des cellules endothéliales spécialisées situées à l’interface entre la circulation et le parenchyme hépatique. Les CSLS ont une morphologie distincte caractérisée par la présence de fenestrae et l’absence de membrane basale. Les CSL JOUENT UN RÔLE ESSENTIEL DANS DE NOMBREUX TROUBLES PATHOLOGIQUES DU FOIE, NOTAMMENT LA DÉRÉGULATION MÉTABOLIQUE, L’INFLAMMATION, LA FIBROSE, L’ANGIOGENÈSE ET LA CANCÉROGENÈSE. Cependant, peu de choses ont été publiées sur l’isolement et la caractérisation des CSLS. Ici, ce protocole traite de l’isolement du LSEC chez les souris saines et non alcooliques de la stéatose hépatique (NAFLD). Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase du foie de souris et la sélection positive de billes magnétiques de cellules non parenchymateuses pour purifier les CSL. Cette étude caractérise les LSEC à l’aide de marqueurs spécifiques par cytométrie en flux et identifie les caractéristiques phénotypiques caractéristiques par microscopie électronique à balayage. Les CSLS isolés selon ce protocole peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles, y compris des essais d’adhérence et de perméabilité, ainsi que des études en aval pour une voie d’intérêt particulière. En outre, ces LSTEC peuvent être regroupés ou utilisés individuellement, ce qui permet la génération de données multi-omiques, y compris l’ARN-seq en vrac ou à cellule unique, la protéomique ou la phospho-protéomique, et le test pour la chromatine accessible à la transposase en utilisant le séquençage (ATAC-seq), entre autres. Ce protocole sera utile pour les chercheurs qui étudient la communication des CSL avec d’autres cellules hépatiques dans les domaines de la santé et de la maladie et permettra une compréhension approfondie du rôle des CSLS dans les mécanismes pathogènes des lésions hépatiques aiguës et chroniques.
Introduction
Les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (CSL) tapissent les parois sinusoïdales hépatiques et sont les cellules non parenchymateuses les plus abondantes dans le foie1. Les CSL SE distinguent des autres cellules endothéliales capillaires ailleurs dans le corps par la présence de fenestrae et l’absence d’une membrane basale classique ou d’un diaphragme 2,3. Par conséquent, les CSLS possèdent des caractéristiques phénotypiques et structurelles distinctives qui améliorent leur perméabilité et leur capacité endocytaire à éliminer une variété de macromolécules circulantes, y compris les lipides et les lipoprotéines. Les CSL JOUENT UN RÔLE CENTRAL DANS LA DIAPHONIE entre les cellules parenchymateuses et non parenchymateuses, telles que les cellules stellaires et les cellules immunitaires. Les CSLS sont essentiels au maintien de l’homéostasie hépatique en maintenant les cellules stellaires et les cellules de Kupffer dans un état de repos4. Les CSL modulent la composition des populations de cellules immunitaires hépatiques en médiant l’adhésion et la migration transendothéliale des leucocytes circulants 5,6. Au cours des lésions hépatiques aiguës et chroniques7, y compris les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI)8, la stéatohépatite non alcoolique (NASH)9 et le carcinome hépatocellulaire (CHC), les CSL subissent des changements phénotypiques connus sous le nom de capillarisation caractérisée par la défenestration et la formation de la membrane basale10. Ces changements phénotypiques dans les CSLS sont associés à un dysfonctionnement des CSLS et à l’acquisition de propriétés prothrombotiques, pro-inflammatoires et profibrogéniques.
Plusieurs méthodes d’isolement des CSL du foie de souris ont été mises au point11. Certaines techniques dépendent de la séparation des cellules non parenchymateuses et parenchymateuses suivie d’une centrifugation par gradient de densité pour purifier les LSTEC des fractions non parenchymateuses. La limitation de cette méthode est la présence de macrophages contaminants dans les dernières étapes de l’isolement des CSEL, ce qui pourrait affecter la pureté des CSEL isolés12. Ce protocole est basé sur la perfusion de collagénase du foie de souris et la sélection positive des billes magnétiques CD146+ de cellules non parenchymateuses pour purifier les CSLS. Les CSLS isolés à l’aide de cette méthode présentent une grande pureté et une morphologie et une viabilité préservées. Ces CSLS sont optimaux pour les études fonctionnelles, y compris les essais de perméabilité et d’adhérence, ainsi que pour les études en aval des voies d’intérêt. De plus, avec l’intérêt croissant pour la génération de grands ensembles de données dans la recherche clinique et la science de la découverte, ces CSL de haute qualité isolés à partir de foies sains et malades atteints de stéatohépatite non alcoolique (NASH) ou d’autres affections peuvent être regroupés ou utilisés individuellement, ce qui permet la génération de données multi-omiques et la comparaison entre la santé et la maladie13,14 . En outre, les LSTEC isolés peuvent être utilisés pour développer des modèles in vitro bidimensionnels et tridimensionnels tels que des organoïdes pour déchiffrer la voie de signalisation activée dans les LSTEC et leur communication intercellulaire avec d’autres cellules hépatiques sous différents stimuli nocifs et en réponse à diverses interventions thérapeutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le présent manuscrit, nous décrivons un protocole d’isolement LSEC du foie de souris consistant en une perfusion de collagénase en deux étapes et un tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) ultérieur. Ce protocole comprend les trois étapes suivantes: (1) Perfusion à travers le PV avec un tampon sans calcium suivi d’un tampon contenant de la collagénase pour obtenir une dispersion des cellules hépatiques; (2) Exclusion des hépatocytes avec centrifugation à basse vitesse; et (3) sélection positive…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales du NIH (1RO1DK122948 à SHI) et le niH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Un soutien a également été fourni à KF par les bourses de recherche à l’étranger de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS). Nous tenons également à remercier le Dr Gregory J. Gores et Steven Bronk pour leur conception originale et l’optimisation de l’appareil de perfusion de collagénase.
Materials
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
Riferimenti
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