Выделение и характеристика первичных синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши
Summary
Здесь мы описываем и демонстрируем протокол первичной изоляции синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши (LSEC). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени, непаренхимальной очистке клеток низкоскоростной центрифугированием и выборе магнитных шариков CD146. Мы также фенотипируем и характеризуем эти изолированные ЛСЭК с помощью проточной цитометрии и сканирующей электронной микроскопии.
Abstract
Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) представляют собой специализированные эндотелиальные клетки, расположенные на границе между кровообращением и паренхимой печени. ЛСЭС имеют отчетливую морфологию, характеризующуюся наличием фенестрат и отсутствием базальной мембраны. ЛСЭС играют важную роль во многих патологических расстройствах печени, включая метаболическую дисрегуляцию, воспаление, фиброз, ангиогенез и канцерогенез. Тем не менее, мало что было опубликовано об изоляции и характеристике LSEC. Здесь в этом протоколе обсуждается изоляция LSEC как от здоровых, так и от неалкогольных мышей с жировой болезнью печени (НАЖБП). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и магнитном отборе непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. Это исследование характеризует ЛСЭС с использованием специфических маркеров с помощью проточной цитометрии и идентифицирует характерные фенотипические особенности с помощью сканирующей электронной микроскопии. ЛСЭС, выделенные в соответствии с этим протоколом, могут использоваться для функциональных исследований, включая анализы адгезии и проницаемости, а также для последующих исследований для конкретного пути, представляющего интерес. Кроме того, эти ЛСЭС могут быть объединены или использованы по отдельности, что позволяет генерировать мультиомные данные, включая объемную или одноклеточную РНК-seq, протеомную или фосфопротеомику и анализ на транспозазно-доступный хроматин с использованием секвенирования (ATAC-seq), среди прочих. Этот протокол будет полезен для исследователей, изучающих связь LSECs с другими клетками печени в области здоровья и болезни, и позволит глубоко понять роль LSECs в патогенных механизмах острого и хронического повреждения печени.
Introduction
Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) выстилают стенки синусоиды печени и являются наиболее распространенными непаренхимальными клетками в печени1. ЛСЭС отличаются от других капиллярных эндотелиальных клеток в других частях тела наличием фенестр и отсутствием классической базальной мембраны или диафрагмы 2,3. Следовательно, ЛСЭС обладают отличительными фенотипическими и структурными характеристиками, которые повышают их проницаемость и эндоцитарную способность устранять различные циркулирующие макромолекулы, включая липиды и липопротеины. LSECs играют ключевую роль в перекрестных помехах между паренхиматозными и непаренхимальными клетками, такими как звездчатые клетки и иммунные клетки. ЛСЭС играют ключевую роль в поддержании гомеостаза печени, сохраняя звездчатые клетки и клетки Купфера в состоянии покоя4. ЛСЭС модулируют состав популяций печеночных иммунных клеток, опосредуя адгезию и трансэндотелиальную миграцию циркулирующих лейкоцитов 5,6. Во время острого и хронического повреждения печени7, включая ишемию-реперфузионное повреждение (IRI)8, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)9 и гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК), ЛСЭС подвергаются фенотипическим изменениям, известным как капилляризация, характеризующаяся дефенестрацией и образованием базальной мембраны10. Эти фенотипические изменения в ЛСЭС связаны с дисфункцией ЛСЭС и приобретением протромботических, провоспалительных и профиброгенных свойств.
Было разработано несколько методов выделения ЛСЭС из печени мышей11. Некоторые методы зависят от разделения непаренхимальных и паренхиматозных клеток с последующим центрифугированием градиента плотности для очистки LSECs от непаренхимальных фракций. Ограничением этого метода является наличие загрязняющих макрофагов на заключительных этапах выделения ЛСЭС, что может повлиять на чистоту изолированных ЛСЭС12. Этот протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и положительном отборе магнитных шариков CD146+ непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. ЛСЭС, выделенные с помощью этого метода, демонстрируют высокую чистоту и сохраненную морфологию и жизнеспособность. Эти ЛСЭС являются оптимальными для функциональных исследований, включая анализ проницаемости и адгезии, а также для последующих исследований интересующих путей. Кроме того, с растущим интересом к созданию больших наборов данных как в клинических исследованиях, так и в науке об открытиях, эти высококачественные ЛСЭС, выделенные как из здоровой, так и из больной печени с неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ) или другими состояниями, могут объединяться или использоваться индивидуально, что позволяет генерировать мультиомические данные и сравнивать здоровье и заболевание13,14 . Кроме того, изолированные ЛСЭС могут быть использованы для разработки двумерных, а также трехмерных моделей in vitro, таких как органоиды, для расшифровки активированного сигнального пути в ЛСЭС и их межклеточной связи с другими клетками печени при различных вредных стимулах и в ответ на различные терапевтические вмешательства.
Protocol
Representative Results
Discussion
В текущей рукописи мы описываем протокол изоляции LSEC из печени мыши, состоящий из двухступенчатой перфузии коллагеназы и последующей магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Этот протокол состоит из следующих трех этапов: (1) перфузия через PV с буфером без кальция с последующим б…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек NIH (1RO1DK122948 to SHI) и NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Поддержку КФ оказывали также зарубежные исследовательские стипендии Японского общества содействия развитию науки (JSPS). Мы также хотели бы поблагодарить доктора Грегори Горса и Стивена Бронка за их оригинальный дизайн и оптимизацию аппарата перфузии коллагеназы.
Materials
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
Riferimenti
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells – gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biologia. 9 (11), 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
