Summary
Mevcut protokol, serbest hareket eden farelerde yetenekli motor davranışın performansında yer alan nöral devreleri karakterize etmek için tek bir pelet ulaşma-kavrama görevinde yüksek hızlı videografi ile birleştirilmiş kablosuz optogenetiğin nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.
Abstract
İnce motor becerileri günlük yaşamda esastır ve çeşitli sinir sistemi bozukluklarında tehlikeye girebilir. Bu görevlerin kazanılması ve yerine getirilmesi duyusal-motor entegrasyonu gerektirir ve iki taraflı beyin devrelerinin hassas kontrolünü içerir. Hayvan modellerinde tek elle yapılan davranışsal paradigmaların uygulanması, striatum gibi beyin yapılarının, görevin yerine getirilmesi sırasında kontrol koşullarında ve hastalıkta belirli çekirdeklerin sinirsel aktivitesinin manipülasyonuna ve kaydedilmesine izin verdiği için karmaşık motor davranışa katkısının anlaşılmasını geliştirecektir.
Kuruluşundan bu yana, optogenetik, nöronal popülasyonların seçici ve hedefli aktivasyonunu veya inhibisyonunu sağlayarak beyni sorgulamak için baskın bir araç olmuştur. Optogenetiğin davranışsal tahlillerle kombinasyonu, spesifik beyin fonksiyonlarının altında yatan mekanizmalara ışık tutmaktadır. Minyatür ışık yayan diyotlara (LED'ler) sahip kablosuz başa monte sistemler, tamamen serbest hareket eden bir hayvanda uzaktan optogenetik kontrole izin verir. Bu, kablolu bir sistemin sınırlamalarının, ışık emisyon verimliliğinden ödün vermeden hayvanların davranışları için daha az kısıtlayıcı olmasını önler. Mevcut protokol, belirli nöronal popülasyonların ince motor davranışa katkısını incelemek için kablosuz optogenetik yaklaşımı yüksek hızlı videografi ile tek manuel bir el becerisi görevinde birleştirmektedir.
Introduction
Motor yetenekli davranış, tarafımızdan gerçekleştirilen çoğu hareket sırasında mevcuttur ve çeşitli beyin bozukluklarında etkilendiği bilinmektedir 1,2,3,4,5,6. Yetenekli hareketlerin gelişimini, öğrenimini ve performansını incelemeye izin veren görevlerin uygulanması, özellikle beyin hasarı, nörodejeneratif ve nörogelişimsel bozukluklar modellerinde motor fonksiyonun nörobiyolojik temellerini anlamak için çok önemlidir 2,7,8,9,10,11,12,13 . Nesnelere ulaşmak ve onları geri almak, günlük yaşam eylemlerinde rutin olarak yapılır ve erken gelişim sırasında edinilen ve daha sonra 5,6 yılları boyunca rafine edilen ilk motor becerilerden biridir. Nesnenin özelliklerinin algılanması, hareket planlaması, eylem seçimi, hareket yürütme, vücut koordinasyonu ve hız modülasyonu7,14,15,16 gibi duyusal-motor süreçler gerektiren karmaşık bir davranışı içerir. Bu nedenle, tek manuel yüksek el becerisi görevleri, her iki yarımkürenin birçok beyin yapısının katılımını gerektirir 16,17,18,19,20,21,22. Farelerde, tek pelet kavrama ulaşma görevi, ayrı ayrı kontrol edilebilen ve analiz edilebilen birkaç aşama için karakterize edilir 7,13,23. Bu özellik, edinim ve davranış performansının farklı aşamalarında spesifik nöronal alt popülasyonların katkısını incelemeye izin verir ve motor sistemlerin ayrıntılı çalışmaları için bir platform sağlar13,23,24. Hareket birkaç saniye içinde gerçekleşir; Bu nedenle, yetenekli motor yörüngesi 7,25'in farklı aşamalarında kinematik analiz için yüksek hızlı videografi kullanılmalıdır. Videolardan vücut duruşu, yörünge, hız ve hata türü25 dahil olmak üzere çeşitli parametreler çıkarılabilir. Kinematik analiz, kablosuz optogenetik manipülasyon 7,23 sırasında ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.
Kablosuz kafaya monte edilmiş bir sistem aracılığıyla ışık iletmek için minyatür ışık yayan diyotların (LED'ler) kullanılması, hayvan görevi yerine getirirken uzaktan optogenetik kontrole sahip olmayı mümkün kılar. Kablosuz optogenetik kontrolör, bir uyarıcıdan gelen tek darbeli veya sürekli tetikleme komutlarını kabul eder ve minyatür LED 23,26'ya bağlı bir alıcıya kızılötesi (IR) sinyaller gönderir. Mevcut protokol, bu kablosuz optogenetik yaklaşımı, ince motor davranışın performansı sırasında spesifik nöronal popülasyonların rolünü incelemek için bir el becerisi görevinin yüksek hızlı videografisi ile birleştirmektedir23. Tek manuel bir görev olduğundan, her iki yarımküredeki yapıların katılımını değerlendirmeye izin verir. Geleneksel olarak, beyin vücut hareketini oldukça asimetrik bir şekilde kontrol eder; Bununla birlikte, yüksek el becerisine sahip görevler, ipsilateral çekirdekler ve 10,20,21,22,23 çekirdekleri içindeki nöronal alt popülasyonların diferansiyel katkısı da dahil olmak üzere birçok beyin yapısından dikkatli koordinasyon ve kontrol gerektirir. Bu protokol, her iki yarımküreden subkortikal yapıların ön ayak23'ün yörüngesini kontrol ettiğini göstermektedir. Bu paradigma, diğer beyin bölgelerini ve beyin hastalığı modellerini incelemek için uygun olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan kullanımını içeren prosedürler yerel ve ulusal kılavuzlara uygun olarak yürütülmüş ve ilgili Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Hücresel Fizyoloji Enstitüsü IACUC protokolü VLH151-19) tarafından onaylanmıştır. Mevcut protokolde 27, 35-40 gün postnatalC57BL/6 arka planlı Drd1-Cre transgenik erkek fareler kullanıldı. Fareler aşağıdaki koşullar altında tutuldu: sıcaklık 22±1 ° C; nem% 55; ışık programı 12/12 saat ışıklar akşam 7'de söndü ve doğum sonrası 21. günde sütten kesildi. Sütten kesilen yavrular 2-5 kişilik aynı cinsiyetten gruplara yerleştirildi. Hayvanlar, mikro bariyer üstleri olan statik konutlara yerleştirildi. Yataklar steril kavak talaşı oluşuyordu. Kemirgen peletleri ve RO-arıtılmış su, belirtilen durumlar dışında, ad libitum sağlandı.
1. Cerrahi işlemler
- İlgilenilen yapının dorsoventral koordinatlarına göre istenen uzunlukta bir LED kanül hazırlayın (ideal olarak kafatasının kalınlığını hesaba katmak için 0,5 mm daha uzun, dorsolateral striatum 3,5 mm için) (Şekil 1).
- Cam elyafını istenen son boyuttan daha uzun bir uzunluğa kadar kesin, elyaf ucunu kaba zımpara kağıdı ile hedef uzunluğa kadar öğütün ve son olarak fiber ucu ince zımpara kağıdı ile cilalayın.
NOT: LED kanül, kızılötesi alıcıya bağlı 250 μm çapında bir cam optik fiberdir (bkz.
- Cam elyafını istenen son boyuttan daha uzun bir uzunluğa kadar kesin, elyaf ucunu kaba zımpara kağıdı ile hedef uzunluğa kadar öğütün ve son olarak fiber ucu ince zımpara kağıdı ile cilalayın.
- Nano enjektör için cam pipetleri (1,14 mm dış çap, 0,53 mm iç çap ve 3,5 uzunlukta) yatay bir çektirme ile çekin (bkz. Malzeme Tablosu) ve daha sonra saklamak için saklayın. Uzun kademeli eğimli konik (4-5 mm) ile 15-20 μm uç çapı elde etmek için çektirmeyi tek bir döngüde programlayın.
- Stereotaksik aparat, kaput, mikro enjektör ( bakınız Malzeme Tablosu) ve çevresindeki yüzeyleri% 70 etanol ile iyice dezenfekte ederek ameliyat alanını hazırlayın.
NOT: Adeno İlişkili Virüsü (AAV'ler) hassas bir şekilde enjekte etmek ve LED kanülünü ilgilenilen bölgeye yerleştirmek için bir fare stereotaksik aparatı gereklidir. - Temiz bir laboratuvar önlüğü veya tek kullanımlık cerrahi elbise, steril eldivenler, yüz maskesi ve tek kullanımlık kafa başlığı dahil olmak üzere prosedür için uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyin.
- Steril cerrahi aletler, pamuklu uçlar, çözeltiler, mikropipet, pipet uçları, kılcal damarlar, mineral yağ ile mikro dolgu ve işaretleyici gibi gerekli ekipmanları ameliyat alanına yakın bir yere yerleştirin.
- Mikroenjeksiyonlar için bir pipeti mineral yağ ile doldurun ve mikro enjektöre yerleştirin. Bazı mineral yağları çıkararak mikro enjektörün doğru çalıştığından emin olun.
NOT: Ameliyat sırasında kullanılan tüm aletler otoklavlanmış ve steril olmalıdır. Aseptik teknik kullanılmalıdır. - Anesteziyi indüklemek için gaz halindeki izofluran ile hayvanları% 4-5 ve ameliyat boyunca% 1.2'sini 0.5-1 L / dak saf oksijen ile anestezi altına alın. Ameliyat ancak hayvan hafif bir tutam sonra pençe çekilmesinin olmaması ile değerlendirilen derin anestezi noktasına ulaştıktan sonra başlar.
- Hayvanın solunum hızını ve sıcaklığını sürekli izleyin. Vücut ısısını 34 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı ile koruyun.
- Bir oftalmik merhem uygulayın. Bir düzeltici ve epilasyon kremi ile saç derisinden saçları çıkarın. Kafa derisini% 8 povidon-iyot ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve% 70 etanol içeren pamuklu çubuklarla silin.
- Fareyi stereotaksik aparata yerleştirin ve kafatasının mediolateral ve anterior-posterior eksenlerde düzleştirilmesini sağlayarak kafayı sabitleyin.
- Sagital eksen boyunca göz hizasında kafa derisinden bir neşter ile 1 cm'lik bir kesi yapın. Kafatasını açığa çıkarmak için cildi geri çekin ve periostu pamuklu çubuklarla temizleyin.
- Kafatası yüzeyini tuzlu su çözeltisi ve steril pamuklu çubuklarla temizleyin. Yüzeydeki kanamaları steril emici göz mızrakları (bakınız Malzeme Tablosu) veya benzeri steril emici malzemeler kullanarak çözün.
- Bir pamuklu çubukla % 2.5'lik bir hidrojen peroksit damlası uygulayın ve kafatası dikişlerini görünür kılmak ve daha iyi bir referansa sahip olmak için birkaç saniye boyunca hareket etmesine izin verin. Birkaç saniye sonra, temiz bir pamuklu çubukla iyice temizleyin.
- Cam pipetle (15 μm son uç çapı) kafatasının ön-arka eksende düzleştirilip düzleştirilmediğini kontrol etmek için bregma ve lambda'yı bulun.
NOT: Cam pipetin ucunu görmek için stereoskopik mikroskop veya USB mikroskop kullanılması önerilir. İhtiyaç duyulması durumunda, kafatasını düzleştirmek için ağız tutucunun yüksekliğini ayarlayın. - Kılcal damarı seçilen ön-posterior (AP) ve medial-lateral (ML) koordinatlara doğru hareket ettirin (dorsolateral striatum AP 1.2 mm, ML 2.28 mm). Seçilen koordinatların üzerindeki kafa derisindeki bir referans noktasını steril bir işaretleyici ile boyayın.
- Referans noktasında, steril bir döner aletle kafatasına hafif basınç uygulayan ~1 mm çapında bir kraniyotomi veya küçük yuvarlak bir diş matkabı ucu ile düşük ila orta hızda diş matkabı uygulayın (bkz.
- Kılcal damarı, Channelrhodopsin eksprese etmek için AAV1-dflox-hChR-2-mCherry gibi 300-400 nL Cre-bağımlı adeno-ilişkili virüs (AAV) veya ilgilenilen bölgede kontrol olarak yalnızca muhabir proteinini (örneğin, mCherry) eksprese etmek için bir AAV ile yükleyin (bkz. Ucun tıkanmadığını kontrol edin, ardından cam pipeti beyne istenen dorso-ventral (DV) koordinatlarda (dorsolateral striatum DV -3.35 mm) yerleştirin.
- Otomatik bir enjektör kullanarak 23 nL/s hızında 200 nL enjekte edin. Enjeksiyonu bitirdikten sonra 10 dakika bekleyin, dökülmeyi önlemek için cam pipeti yavaşça çekin.
NOT: Uygun mikro enjektör ile enjekte etmek için 30 G'lık bir iğne kullanmak mümkündür.
- Otomatik bir enjektör kullanarak 23 nL/s hızında 200 nL enjekte edin. Enjeksiyonu bitirdikten sonra 10 dakika bekleyin, dökülmeyi önlemek için cam pipeti yavaşça çekin.
- Kalıntıları pamuklu çubuklarla temizleyin ve kurutun.
- Steril cam LED kanülünü stereotaksik kola takın ve referans olarak bregma kullanarak koordinatları kalibre edin. Doku hasarını önlemek için kanülü çok yavaş (300 μm / dak) yerleştirin ve enjeksiyon bölgesinin 100 μm yukarısına yerleştirin.
- LED kanül yerleştirildikten sonra, kraniyotominin kenarına bir damla (100 μL) doku yapıştırıcısı ekleyin.
- Elyafı kafatasına sabitlemek için üreticinin talimatlarını izleyerek diş çimento karışımı hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Kısaca, çimento setlerinden önce daha fazla çalışma süresine sahip olmak için soğutulmuş bir porselen kalıp kullanın. Porselen kalıba 2 kepçe reçine berrak tozu ekleyin, 4 damla hızlı baz ve 1 damla katalizör ekleyin, sonra iyice karıştırın. Toz/sıvı oranı, daha ince veya daha kalın bir viskoziteye ihtiyaç duyulduğunda ayarlanabilir. - Steril bir fırça kullanarak, diş çimento karışımını kanül konektörünün etrafına azar azar uygulayın, kafatası kaplanana ve konektör kafatasına güvenli bir şekilde tutturulana kadar katmanlar oluşturarak pimleri tamamen serbest bırakın. Farenin derisine diş çimentosu almaktan kaçının.
- Tamamen kurumaya bırakın.
- İmplant çevresindeki cildi doku yapıştırıcısı kullanarak kapatın (bkz.
- Fareyi 33 ° C'de bir ısıtma yastığı üzerinde bir kurtarma kafesine yerleştirin Aşağıdaki ağrı / rahatsızlık belirtilerinden bir veya daha fazlasının varlığını izleyin: 1) Kambur, motor aktivitesinin eksikliği veya azalması, 2) Bakımsız kirli bir paltoya yansıyan tımar edilmemesi, 3) Aşırı yalama veya çizilme, kesi yerinde kızarıklık, 4) agresif davranış, 5) anoreksiya veya dehidrasyon ve 6) Yuva oluşumu eksikliği.
NOT: İmplantın ayrılmasını önlemek için fareyi tüm işlemler sırasında ayrı ayrı kafeste tutun. Kanülün ayrılması durumunda, 150 mg / kg sodyum pentobarbital enjekte ederek ötenazi uygulayın ve ardından derin anesteziye ulaşıldıktan sonra dekapitasyon yapın. - Analjezi sağlamak için ameliyat sonrası üç gün boyunca günde bir kez deri altından (SC) meloksikam 1 mg / kg enjekte edin.
- Diğer işlemlerden önce tam iyileşme için en az 7 gün ve opsin ekspresyonu için 14 gün bekleyin.
NOT: Üç gün boyunca her 12 saatte bir ameliyat sonrası takip yapın, ardından deneyin sonunda ötenazi gününe kadar her gün hayvanları kontrol edin.
2. Kavrama eğitimi
- Ameliyat sonrası 7. günde, gıda yoksunluğu protokolü28'e başlayın. Ortalama ad libitum vücut ağırlıklarını belirlemek için fareleri art arda üç gün boyunca tartın. Daha sonra, hayvanların vücut ağırlığının yaklaşık% 90'ını ve en az% 85'ini korumak için yeterli besin alması için gıda kısıtlamaları planlayın.
NOT: Bu, günlük 2,5-3 g yiyecek sağlayarak elde edilir. Hayvanların ağırlığını günlük olarak izleyin ve hayvanların davranışlarını ve görünümlerini, örneğin ceket ve göz görünümünü gözlemleyerek genel refah için puan alın. Referans29'daki vücut durumu puanlama sistemini kullanın. - Ön eğitim, eğitim ve test dönemlerinde, her fareye standart gıda peletlerinin yanı sıra günde 20 pelet (20 mg tozsuz çikolata aromalı pelet ) (bkz.
- Alışkanlıktan üç gün önce, ev kafeslerine 0.4 g / hayvan / gün 20 mg tozsuz çikolata aromalı pelet saçarlar, böylece fareler kavrama görevi sırasında ödül görevi gören peletlerle tanışırlar.
- Fareleri, ön eğitimden bir gün önce test odasına 10 dakika yerleştirerek, oda tabanına dağılmış peletlerle alışkanlık haline getirin (Şekil 1A).
- Eğitim ve testten sonra günlük yiyeceklere izin verin. Her gün benzer bir program tutun.
- Ön eğitimin ilk gününde, fareleri kavrayışa kadar uzanma odasına yerleştirin ve önden gözlemleyin. Peletleri, odanın önüne, açıklığa yakın bir yere yerleştirin, böylece peletleri tüketmeye başlarlar. Bu aşamada, farelerin peletleri herhangi bir biçimde yakalamalarına izin verilir.
- Ön eğitimin ikinci gününde, peletleri girintiye (açıklıktan 1 cm) alana kadar açıklıktan daha uzağa ve daha uzağa yerleştirin, böylece fareler kavrama hareketlerini şekillendirebilirler (Şekil 1C).
- Fareleri kafesin arkasına koşmaları için eğitin ve denemeleri bireyselleştirmek için bir strateji olarak bir sonraki yiyecek peletini almak için kafes açıklığına geri dönün.
NOT: Bu, her deneme için girintiye bir pelet yerleştirmeden önce farenin kafesin arkasına gelmesini bekleyerek elde edilebilir. - Sağ veya sol pençeleri tarafından kavranacak peletleri yerleştirin.
NOT: Fareler, aşağıdaki eğitim ve test günlerinde kullanılacak olan kavramak için tercihen bir pençe kullanmaya başlar. - Hayvanları 6 gün boyunca 20 deneme süren günlük seanslarda veya en fazla 10 dakika geçene kadar eğitin. Eğitimin 2. gününden itibaren, sahte alıcıyı (boyutlar 12 x 18 x 7 mm, 1 g, bakınız Malzeme Tablosu) koyun, böylece fareler görevi yerine getirirken ağırlığa alışırlar (Şekil 1B). Her gün isabet ve kaçırılan denemelerin sayısını puanlayın.
- Normal bir kamera ile davranışı kaydedin ve odanın önünden 30-60 kare / s yakalayın. Ek olarak, hayvanların duruşunu izlemek için eğitim odasının altına 45° açıyla bir ayna yerleştirilebilir (Şekil 1D,E).
- Post-hoc kinematik analiz için (Şekil 2), kafesin yanından kayıt yapmak üzere 45°'lik bir açıyla yüksek hızlı bir kamera (bkz. Malzeme Tablosu) monte edin. 3D analiz gerekiyorsa, odanın önünden 35° açıyla kayıt yapmak için ikinci bir yüksek hızlı kamera yerleştirin; her iki kamera da hayvanların yanlılığına bağlı olarak kafesin sağ veya sol tarafına yerleştirilmeli ve aynı kare hızında çekim yapmalı ve senkronize edilmeli7 (Şekil 3D,E).
- Yüksek hızlı kameraları, mümkünse 376 x 252 piksel veya daha fazla çözünürlüğe sahip 100 kare / sn'ye ayarlayın. Arka planı azaltmak ve kontrastı artırmak için odanın yanlarına ve arkasına beyaz strafor duvarlar yerleştirin (Şekil 1E).
- Test gününde, kablosuz optogenetik stimülasyon için sahte üniteyi bir kızılötesi alıcı ile değiştirin (Şekil 1B, C).
- Fareler ulaşmaya başladığında, davranışın gerçekleştirildiği süre boyunca ve 2 saniyeden uzun süre sürekli bir uyarım olması için LED kanülü uzaktan kumandayla manuel olarak çevirin. Otomatik bir stimülasyon paradigmasının programlanması tercih edilir. Stimülasyon cihazı, 1,0 mW/mm2 ucunda yoğunlukta 470 nm'lik (mavi ışık) bir LED'i tetikler.
- Puanlama ve kinematik analiz dahil olmak üzere daha fazla inceleme için videoları toplayın.
3. Post-hoc histolojik doğrulama
- Bir deneyin tamamlanmasının ardından, viral ekspresyonu ve LED kanül yerleşimini onaylayın. Hayvanı 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin kokteyli ile uyuşturun. Fare derin anestezi belirtileri gösterdiğinde (adım 1.7), buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından% 4 PFA ile perfüze edin.
- İmplante edilmiş kanülü, konektörü forseps ile sıkıca kavrayarak ve yavaşça yukarı çekerek dikkatlice çıkarın.
- Beyni% 4 PFA23'te 24 saat boyunca çıkarın ve sabitleyin.
- PBS ile 3-10 dakikalık yıkamalar yapın.
- Beyni bir mikrotom kullanarak 50 μm bölümler halinde kesin (bkz.
- Çekirdekleri boyamak ve slaytları örtmek için DAPI içeren sert ayarlı montaj ortamına sahip bölümleri slaytlara monte edin.
- Kuruduktan sonra, konfokal mikroskop altındaki bölümleri gözlemleyin ve herhangi bir floresan proteini ile kaynaşmış Ch2R'nin implante edilmiş kanül yerini ve ekspresyonunu doğrulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kavrama yeteneği görevi, farklı deneysel manipülasyonlar altında ince beceri hareketinin şekillendirme, öğrenme, performans ve kinematiğini incelemek için yaygın olarak kullanılan bir paradigmadır. Fareler görevi birkaç gün içinde yerine getirmeyi öğrenir ve 5 günlük eğitimden sonra bir platoya ulaşan% 55'ten fazla doğruluk elde eder (Şekil 2A, B). Daha önce bildirilenlere benzer şekilde, hayvanların bir yüzdesi görevi uygun şekilde yerine getirmemektedir (% 29.62) ve bunlar daha fazla analizden hariç tutulmalıdır30. Bunlar, eğitimin başlangıcından itibaren peletten çok uzağa nişan alan hedefi kaçıran veya pelet üzerinde doğru pozisyonda olmadan önce kavrama hareketini gerçekleştiren, öğrenmeyen farelerin (6/54 fareler,% 11.1) bir alt kümesini içerir. İlk eğitim günlerinde, başka bir grup görevi yüksek doğrulukla yerine getirdi, ancak 3-4. güne kadar peletten çok uzağa nişan alarak kötü performans göstermeye başladı (10/54 fareler,% 18.51). Bu grupta, bazı fareler tercih edilen bir pençe kullanarak eğitime başlar, ancak birkaç gün sonra tercihlerini değiştirir; bu daha önce Chen ve ark., 201430 tarafından tartışılmıştır.
Kavrama ulaşma hareketi, denemeden denemeye ve hayvanlar içinde oldukça basmakalıptır (Şekil 2). Yüksek hızlı videografinin kullanılması, hareketlerin yörüngesinin izlenmesine izin verir ve kontrol durumundaki farklı fazlarda ve optogenetik stimülasyon sırasında kinematiklerin analiz edilmesini mümkün kılar (Şekil 1E ve Şekil 2C). Bu yaklaşım, kat edilen mesafe, hız, ivmelenme, bitiş noktası ve yörünge gibi parametrelerin ölçülebilir bir değerlendirmesiyle sonuçlanır (Şekil 2 C-E). Hem farenin peleti almadan önce birden çok kez ulaştığı çoklu erişim denemelerini hem de farenin peleti tek bir ulaşma hareketiyle aldığı tek deneme olaylarını analiz etmek mümkündür. Deneme, hayvanlar peleti uzaklaştırdığında veya kafesin arkasına giderek denemeyi yeniden başlattığında sona erer. Farklı deney koşulları altında yörüngelerin nicel bir karşılaştırması, ana bileşen analizi (PCA) ve ardından k-ortalamaları kümelemesi (Şekil 3J-K) 23,25 ile elde edilir.
Çoğu eğitim seansı sırasında, fareler bazen peleti kavrayamazlar (kaçırılan denemeler). Bazı manipülasyonlar, kaçırılan denemelerin sayısını ve dolayısıyla görevin doğruluğunu değiştirir. Ardından, isabet ve kaçırılan denemeler arasındaki farkları analiz etmek önemlidir. Ellerimizde, kaçırılan denemeler, hareketin üç ayrı aşamasındaki değişikliklerden kaynaklanmaktadır: (1) pençe, oda açıklığını geçmeden önce yörüngesini değiştirir (ilk hata), (2) pençe, pençe açıklığı geçtikten sonra yörüngesini değiştirir (son hata) ve (3) pelet toplamadaki başarısızlık (kavrama hatası) (Şekil 2 I, J)13 . Kaçırılan denemelerin genel bir özelliği, farelerin kavrama hareketini vuruş denemelerine kıyasla peletten (son nokta) daha uzakta başlatmasıdır (Şekil 2G). Ek olarak, fare duruşu ile ilişkili ıskalamalar, isabet ve kaçırılan denemeler arasındaki vücut açısında anlamlı farklılıklar olarak ölçülür (Şekil 2H).
Optogenetik ile hedeflenen yapıya veya nöronal popülasyona bağlı olarak, davranış üzerinde farklı etkiler beklenebilir7,19,23,31,32,33. Mevcut protokol, kontralateral veya ipsilateral yarımkürelerde striatumdaki dikenli projeksiyon nöronlarının (SPN'ler) aktive edilmesinin, ulaşılan hareket sırasında fare tarafından kullanılan tercih edilen pençe hakkındaki etkisini açıklamaktadır (Şekil 3). Bazal gangliyon doğrudan yoluna köken veren SPN'leri eksprese eden D1 dopaminin kontralateral aktivasyonu, kavrama başarısını kontrol koşullarına kıyasla% 64.9±8.8'e düşürmüştür (Şekil 3B). Kinematik analiz, optogenetik stimülasyon sırasında, pençe yörüngesinin, seyahat edilen mesafenin kontrolün% 218.4±19.2'sine yükselmesiyle gösterilen ve peleti hedefleyememeye ve ilk hata tipi I'de bir artışa yol açan bir salınım paterni tanımladığını ortaya koymaktadır (Şekil 3F). PCA analizi, kontralateral D1 SPN'lerin aktivasyonu sırasındaki tüm çalışmaların yörüngelerinin, bir kontrol kümesiyle neredeyse hiç örtüşmeyen bir kümede ayrıldığını ve düşük bir benzerliğe işaret ettiğini göstermektedir (Şekil 3J-K).
Öte yandan, ipsilateral taraftaki dSPN'lerin aktivasyonu, PCA analizi ile gösterilen yörünge dağılımında bir artışa yol açmaktadır (Şekil 3K), ulaşılan başarıyı (120.7±23.6%, n = 4), kat edilen toplam mesafeyi (% 136.3±35.5) veya ulaşma aşamasındaki maksimum hızı (% 117.3±10.3) etkilemeden, ipsilateral D1 SPN'lerin aktivasyonunun davranışsal sonucu değiştirmeden bir dereceye kadar ulaşma yörüngesini değiştirdiğini göstermektedir (Şekil 3G-I) ). Kinematik analiz, ipsilateral manipülasyon yoluyla hareket kontrolündeki ince değişiklikleri gösterir. Son olarak, vücut duruşu analizi, kontralateral D1SPN aktivasyonu sırasında vücut açısında bir kayma olduğunu göstermektedir (Şekil 3L). Bu basit görevin bile, bir hedefe ulaşmak için uygun hareket yürütmeye izin veren birçok bileşene sahip olduğu vurgulanmaktadır.
Resim 1: Deney düzeneği . (A) Davranış odasının şemaları. Cm cinsinden aşağıdaki boyutlara sahip akrilik levhadan yapılmış bir oda: 18,5 (y) x 8,5 (g) x 20 (d), ön penceresi 1 (g) x 5 (y) ve küçük bir rafı 8,5 (g) x 4 (d). (B) LED kanülün (solda) ve kablosuz alıcının (sağda) fotoğrafı. (C) Kavramaya ulaşma görevini yerine getirirken implante edilmiş LED kanülü alıcıya bağlı bir farenin yandan görünümü (beyaz ok ucu alıcıyı, yıldız işareti kanülü tutan diş çimentosunu ve boş ok ucu topağı gösterir). (D) Deney düzeneğinin taslağı. İki yüksek hızlı kamera, erişimi iki boyutta kaydederken, üçüncüsü, farenin odanın altındaki aynadan konumu da dahil olmak üzere görevin panoramik bir görünümünü topladı. Hayvanlar tercih ettikleri pençeyi seçmekte özgürdüler ve stimülasyon tarafları her zaman tercih edilen pençenin tarafına atıfta bulunur. (E) Bir deneme sırasında kameraların tam konumu ve her kameranın temsili görüntüsü. Bu şekil Referans23'ten uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ulaşma davranışının kinematik analizi. (A) Deneyin 0. günden (d0) 25. güne (d25) kadar olan zaman çizelgesi. (B) Pelet alma doğruluğu olarak ölçülen kavrayışa ulaşma görevi sırasındaki performans (toplam başarılı kavrama sayısı/toplam deneme sayısı x 100). (C) Yüksek hızlı bir videodan yörünge izleme örneği. (D) Vuruş sırasında pençenin bireysel yörüngeleri ve kaçırılan denemeler. (E) Vuruş sırasında pençe tarafından kat edilen toplam mesafe ve kaçırılan denemeler. (F) Pençenin vuruştaki yörünge boyunca hızlanması ve mesafeye karşı mesafe olarak çizilen denemeleri kaçırması. hız. (G) Vuruş = 3,16 mm, 6,08 mm'yi kaçıran uç nokta mesafesinin özeti (Mann-Whitney-Wilcoxon testikaçırıldı ve isabet U = 4184, s<0,0001, n = 28 fare). (H) İki tür denemede vücut açısındaki farklılıklar, özlüyor = 8.4±5.3°, 6.7±4° isabet ediyor (Mann-Whitney-Wilcoxon testi U = 6437, P = 0.0243, n = 28 fare). (I) Üç hata türünün şemaları. (J) Kontrol koşullarında fareler tarafından yapılan üç tür hatanın oranları. Bu şekil Referans23'ten uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kavrama davranışı sırasında kontralateral ve ipsilateral D1 SPN'lerin optogenetik aktivasyonu . (A) Stimülasyon paradigmasının şemaları. (B) Stimülasyon dışı çalışmalara kıyasla başarı oranı. (C) Kontrol koşullarına kıyasla seyahat edilen mesafedeki değişim. (D), (G) Optogenetik stimülasyon ile ve optogenetik stimülasyon olmadan pençe tarafından yapılan iki boyutlu yol grafikleri. (E) , (H) Ulaşma hareketleri sırasında pençenin kat ettiği toplam mesafe. (F) , (I) Farklı hata türlerinin dağılımlarının özeti. D1 kontralateral: İlk hata veya tip I (kontrol = 18.2±11.6 %, stimülasyon = 79.9±8.2 % Fisher'ın kesin testi, s<0.0001). (J) D1SPN'lerin kontralateral aktivasyonuna kıyasla kontrol koşullarındaki yörüngelerin PCA analizi örneği. Gölgeli alan her koşulun kümesini temsil eder ve yıldız küme merkezcidir. (K) Farklı deney koşullarının kümeleri arasındaki örtüşmenin özeti. (L) Vücut açısındaki değişiklikler. Bu şekil Referans23'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İyi tanımlanmış davranışsal paradigmalarda nöronal popülasyonların optogenetik manipülasyonunun kullanılması, motor kontrolün altında yatan mekanizmalar hakkındaki bilgilerimizi ilerletmektedir 7,23. Kablosuz yöntemler özellikle birden fazla hayvan üzerinde test veya serbest dolaşım gerektiren görevler için uygundur34,35. Bununla birlikte, teknikler ve cihazlar rafine edildiğinden, optogenetik34,36 ile birlikte herhangi bir davranışsal görev için başvurulacak seçenek olmalıdır.
Mevcut yöntemin birçok avantajı vardır, çünkü minyatür LED'ler yüksek yoğunlukta güvenilir bir ışık kaynağı sağlar ve implantlar birkaç gün boyunca stimülasyon gerektiren çalışmalarda kullanılabilir. Bununla birlikte, opsin stimülasyonu için bir optik fiberin yerleştirilmesi beyin dokusuna mekanik olarak zarar verebilir, enfeksiyonlara ve bazen kanül37'nin bulunduğu yerde iltihaplanmaya neden olabilir. Uzun süreli yüksek frekanslı optogenetik stimülasyonun ısı ürettiği ve fototoksite neden olabileceği gösterilmiştir37. Isı oluşumunu azaltan kırmızı veya hatta yakın kızılötesi ışıkla aktive edilen kırmızıya kaymış efektör opsinler kullanarak fototoksisiteyi azaltmak mümkündür38.
Ayrıca, alıcıyı bağlamak için pimler kafatasının dışında kaldığından, bazen diş çimentosu doğru uygulanmazsa fareler kanülün yer değiştirmesine veya ayrılmasına neden olabilir; bu genellikle beyin dokusunun hasar görmesine yol açar ve daha fazla analiz için dikkate alınacak denek sayısını azaltır. Son gelişmeler, beyin dokusunun derinliklerine nüfuz eden yakın kızılötesi ışığa yanıt olarak yukarı dönüşüm lüminesansı yoluyla görünür ışık yayabilen parçacıkları kullanan lifsiz optogenetiği ortaya çıkarmıştır36. Fibersiz cihazlar, fark edilmeyen implantlara sahip serbestçe davranan hayvanlarda daha uzun zaman dilimlerinde optogenetik olarak uyarma fırsatı sunar35. Bu, su labirentlerinde bile sınırsız harekete izin verir, birden fazla hayvanın bir arada barındırılmasına (sosyal izolasyonun etkisinden kaçınmak için) ve hayvanları daha doğal ortamlarda incelemeye izin verir35,36.
Lifsiz optogenetiğin sunduğu tüm avantajlara rağmen, hala biyouyumluluk ve ısı üretimi zorluklarıyla karşı karşıyadır. Foton dönüşümünün etkinliği de onu sınırlar. Son olarak, yüksek emisyon verimliliği34,36 için daha fazla iyileştirme gereklidir.
Bu paradigmanın yüksek hızlı videografi ile kombinasyonu, farklı deneysel koşullar altında kinematik analize izin verir. Bu, davranış ve motor kontrolünün farklı bileşenleri üzerindeki ince etkilerin bile hassas bir şekilde algılanmasını sağlar. Daha analitik araçlar geliştikçe, çevrimiçi kinematik analize ve motor davranışın farklı bağlamlarda derinlemesine bir karakterizasyonuna sahip olmak mümkündür. Fareye ulaşan hareket kinematiğinin kapsamlı bir ölçümü yakın zamanda Becker ve ark.25 tarafından yayınlanmıştır.
Minimal invaziv tekniklerle serbestçe hareket eden hayvanlarda nöronal popülasyonları seçici olarak manipüle etme olasılığı, belirli nöronal tiplerin kesin davranışsal görevlere katkısının incelenmesine izin verir23. Kavrama ulaşma görevi, motor davranış için çevrilebilir bir paradigmadır13,19. Korunmuş beyin yapılarının, görevin edinilmesi, öğrenilmesi ve yerine getirilmesinin farklı aşamalarına katıldığı bilinmektedir 7,12,23. Bu davranışın altında yatan nöral devrelerin ortaya çıkarılması, motor kontrolünün anlaşılmasını artıracaktır. Birçok çalışma, özellikle yüksek el becerisine ihtiyaç duyulduğunda, tek manuel görevler üzerinde bi-hemisferik kontrolün önemini vurgulamaktadır20,21,22. Optogenetik manipülasyonlarla birleştirilen kinematik analiz, bu karmaşık davranışın farklı mekanizmalarının araştırılmasına izin verir. Normal koşullarda ve hastalık modellerinde duyusal-motor geri bildirimin katkısını analiz etmeye yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir açıklama beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma UNAM-PAPIIT projesi IA203520 tarafından desteklenmiştir. IFC hayvan tesisine, fare kolonilerinin bakımı konusundaki yardımları ve BT desteği için hesaplama birimine, özellikle Francisco Perez-Eugenio'ya teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
References
- Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738 (2018).
- Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
- MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
- Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
- Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720 (2019).
- Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41 (2018).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
- Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).
- Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G.
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
- Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
- Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
- Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
- Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
- d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
- Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
- vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742 (2011).
- vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
- Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
- Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651 (2021).
- Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
- Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
- Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
- Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
- Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
- Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
- Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238 (2014).
- Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
- Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834 (2017).
- Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
- Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
- Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
- Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961 (2016).
- Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
- Packer, A. M., et al. Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).
