Utilisation d’un analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel pour surveiller la bioénergétique des ostéoblastes

Summary

Le test de flux métabolique cellulaire en temps réel mesure le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire, qui correspond à la production mitochondriale et glycolytique d’adénosine triphosphate, à l’aide de capteurs de pH et d’oxygène. Le manuscrit explique une méthode pour comprendre l’état énergétique des ostéoblastes et la caractérisation et l’interprétation de l’état bioénergétique cellulaire.

Abstract

La formation osseuse par les ostéoblastes est un processus essentiel pour une acquisition osseuse et un renouvellement osseux appropriés afin de maintenir l’homéostasie squelettique et, en fin de compte, de prévenir la fracture. Dans le but d’optimiser la masse osseuse maximale et de lutter contre diverses maladies musculo-squelettiques (c.-à-d. l’ostéoporose post-ménopausique, l’anorexie mentale, le diabète sucré de type 1 et 2), des efforts incroyables ont été déployés dans le domaine de la biologie osseuse pour caractériser pleinement les ostéoblastes tout au long de leur processus de différenciation. Compte tenu du rôle principal des ostéoblastes matures dans la sécrétion de protéines matricielles et de vésicules de minéralisation, il a été noté que ces processus prennent une quantité incroyable d’énergie cellulaire, ou adénosine triphosphate (ATP). L’état énergétique cellulaire global est souvent appelé bioénergétique cellulaire, et il comprend une série de réactions métaboliques qui détectent la disponibilité du substrat pour dériver l’ATP pour répondre aux besoins cellulaires. Par conséquent, la méthode actuelle détaille le processus d’isolement des cellules stromales primaires de la moelle osseuse murine (BMSC) et de surveillance de leur état bioénergétique à l’aide de l’analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel à différents stades de la différenciation des ostéoblastes. Il est important de noter que ces données ont démontré que le profil métabolique change radicalement tout au long de la différenciation des ostéoblastes. Ainsi, l’utilisation de ce type de cellule physiologiquement pertinent est nécessaire pour apprécier pleinement comment l’état bioénergétique d’une cellule peut réguler la fonction globale.

Introduction

La formation d’os par l’ostéoblaste s’accompagne d’une destruction ou d’une résorption coordonnée des os par les ostéoclastes. L’équilibre entre la formation osseuse ostéoblastique et la résorption des ostéoclastes est un processus couplé décrivant le renouvellement osseux ou le remodelage, ce qui est essentiel pour l’homéostasie squelettique. Le dysfonctionnement ostéoblastique entraîne une altération de la formation osseuse et entraîne diverses maladies, y compris l’ostéoporose ^1,2,3. La différenciation ex vivo/in vitro des cellules souches stromales de la moelle osseuse (BMSC) en précurseurs d’ostéoblastes et en ostéoblastes matures entraîne la formation et le dépôt de la matrice osseuse minéralisée dans le récipient de culture au fil du temps ^4,5,6. Cette formation osseuse par l’ostéoblaste nécessite une quantité importante d’énergie cellulaire. Plus précisément, il a été démontré que la synthèse et la sécrétion de collagène dépendent fortement des rapports cellulaires ATP: ADP, et vraisemblablement, le trafic et la sécrétion de vésicules minéralisées nécessitent de ^{l’ATP supplémentaire} 7,8,9,10,11. De nombreux chercheurs ont démontré que le processus d’ostéoblastogenèse et de fonction ostéoblastique nécessite un apport adéquat d’énergie pour répondre à la demande métabolique de la formation osseuse ^{12,13,14,15,16}. Par conséquent, l’objectif de cette méthode est de caractériser l’état bioénergétique des cellules stromales murines primaires tout au long de la différenciation ostéoblastique à l’aide de l’analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel. Ces techniques aident à développer une meilleure compréhension de l’homéostasie squelettique, ce qui pourrait finalement conduire au développement de nouvelles options thérapeutiques capables d’améliorer les troubles squelettiques.

L’analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel peut être utilisé pour mesurer le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) des ostéoblastes vivants, ce qui correspond à la production mitochondriale et glycolytique d’ATP, respectivement. Le fait qu’un ion H⁺ par lactate soit libéré lors de la glycolyse lors de la conversion du glucose en lactate, ce qui modifie le pH du milieu reflété dans les valeurs ECAR est fondamental pour cette méthodologie. Inversement, au cours du cycle TCA (acide tricarboxylique), la phosphorylation oxydative via les mitochondries produit du CO₂ en utilisant ou en consommant de l’oxygène, et donc la surveillance de l’OCR reflète ce processus métabolique. L’analyseur mesure à la fois l’OCR et l’ECAR dans le microenvironnement extracellulaire simultanément et en temps réel, ce qui permet un potentiel énorme lors de l’étude de la bioénergétique cellulaire ^6,17. De plus, l’exécution de ces tests est relativement simple et facilement personnalisable en fonction de l’objectif expérimental. Des techniques similaires ont été utilisées pour mieux comprendre la régulation métabolique des lymphocytes T du système immunitaire^18,19, l’initiation et la progression du cancer²⁰, ainsi que de multiples autres types de cellules contribuant aux syndromes métaboliques^21,22.

Les avantages de l’analyseur de flux métabolique en temps réel par rapport aux techniques alternatives comprennent (1) la capacité de mesurer la bioénergétique cellulaire de cellules vivantes en temps réel, (2) la capacité d’effectuer des essais avec un nombre relativement faible de cellules (nécessite aussi peu que 5 000 cellules), (3) des ports d’injection pour manipuler en parallèle plusieurs traitements dans un système à haut débit de 96 puits, (4) l’utilisation d’un imageur de cellules automatisé sans étiquette radioactive pour la normalisation^{18, 23,24}. Les méthodes suivantes visent à fournir une description généralisée mais détaillée de la surveillance de la bioénergétique cellulaire dans les BMSC murins tout au long de la différenciation des ostéoblastes à l’aide de l’analyseur. Il comprendra des tests effectués régulièrement; cependant, comme pour de nombreuses techniques et méthodes, il est fortement encouragé que les laboratoires individuels déterminent des détails spécifiques pour leurs expériences.

Sélection de tests et différents types de tests disponibles: Une grande variété de kits de dosage et de réactifs sont disponibles pour étudier la bioénergétique des cellules tout en assurant la fiabilité et la cohérence des résultats expérimentaux. En outre, le logiciel de bureau propose également des modèles de test qui peuvent être facilement personnalisés. Le test peut être défini en fonction des besoins de l’utilisateur pour mesurer différents paramètres métaboliques. Ces essais peuvent être modifiés de différentes manières en fonction de l’objectif expérimental et/ou de la question scientifique. Par exemple, avec quatre ports d’injection, plusieurs composés peuvent être injectés dans le milieu d’essai pour analyser la réponse cellulaire spécifique à chaque voie métabolique.

Test de phénotype d’énergie cellulaire: Ce test mesure le phénotype métabolique et le potentiel métabolique des cellules vivantes. Ce test est également recommandé comme première étape pour avoir une idée généralisée du métabolisme spécifique à la voie. Un mélange d’oligomycine A-un inhibiteur de l’ATP synthase et de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP)-un agent de découplage mitochondrial est injecté pour comprendre le potentiel énergétique cellulaire. L’injection d’oligomycine A inhibe la synthèse de l’ATP, entraînant une augmentation du taux de glycolyse (ECAR) pour permettre aux cellules de répondre à leurs besoins énergétiques; d’autre part, l’injection de FCCP entraîne une OCR plus élevée en raison de la dépolarisation de la membrane mitochondriale. Essentiellement, ce test décrit la respiration métabolique basale et, après les doubles injections, poussées ou stress, la réponse métabolique. Sur la base de ces paramètres, le logiciel trace ensuite l’OCR et l’ECAR des cellules en classant les cellules en état aérobie, quiescent, glycolytique ou énergétique au fil du temps^25,26.

Test du taux de production atp en temps réel : Cela mesure la production cellulaire d’ATP simultanément à partir de la glycolyse et de la respiration mitochondriale. Ce test mesure quantitativement les changements métaboliques des deux voies énergétiques et fournit des données sur les taux de production d’ATP mitochondrial et glycolytique au fil du temps. Le test obtient des données OCR et ECAR basales suivies du calcul du taux de production mitochondrial d’ATP par injection d’oligomycine A et du taux de production d’ATP glycolytique par injection de mélange roténone + antimycine A (inhibition totale de la fonction mitochondriale), entraînant une acidification mitochondriale^17,27.

Test de stress des mitochondries cellulaires (ou test d’effort mito cellulaire): Cela mesure la fonction mitochondriale par la respiration liée à l’ATP, quantifie la bioénergétique cellulaire, identifie le dysfonctionnement mitochondrial et mesure la réponse des cellules au stress. Divers paramètres, y compris la capacité respiratoire basale et de rechange, la respiration liée à l’ATP, la respiration maximale et la consommation d’oxygène non mitochondriale, peuvent être obtenus en un seul test. Ce test implique des injections séquentielles d’oligomycine A, fccP (agent de découplage mitochondrial), un mélange d’inhibiteurs de roténone / antimycine A pour analyser efficacement l’effet de ceux-ci sur la fonction mitochondriale²⁸.

Flexibilité mito fuel flex test: Cela mesure le taux de respiration mitochondriale par l’oxydation des trois combustibles mitochondriaux primaires par la présence et l’absence de leurs inhibiteurs. L’inhibition séquentielle du glucose, de la glutamine et des acides gras aide à mesurer la dépendance, la capacité et la flexibilité des cellules et la dépendance des cellules dans diverses voies cellulaires pour répondre à la demande d’énergie. Lorsque les mitochondries ne peuvent pas répondre aux exigences de la voie d’intérêt bloquée en oxydant d’autres combustibles, les cellules entrent dans un état de dépendance. La capacité des cellules est calculée par inhibition des deux autres voies alternatives suivies de l’inhibition de la voie d’intérêt. La flexibilité des cellules aide à comprendre la capacité des mitochondries à compenser et à répondre aux besoins en carburant de la voie inhibée. Il est calculé en soustrayant la dépendance des cellules de la capacité des cellules. Trois inhibiteurs différents sont utilisés indépendamment ou sous forme de mélange de deux pour calculer efficacement les paramètres du test. L’acide 2-cyano-3-(1-phényl-1H-indol-3-yl)-2-propénoïque (UK5099) inhibe l’oxydation du glucose en bloquant le transporteur de pyruvate dans la glycolyse. Le sulfure d’éthyle bis-2-(5-phénylacétamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) inhibe la voie d’oxydation de la glutamine et l’étomoxir inhibe l’oxydation des acides gras à longue chaîne²⁹.

Figure 1 : Représentation schématique de la méthodologie de culture et de préparation des ostéoblastes pour analyse. Les BMSC murins sont isolés à partir d’os longs, cultivés et ensemencés dans des plaques de 96 puits à une densité de 25 000 cellules/puits. La culture de ces cellules dans des milieux spécifiques aux ostéoblastes commence lorsqu’elles atteignent une confluence de 80% à 100% pour commencer leur différenciation. Les tests sont effectués à différents stades de différenciation. Les plaques de cartouche sont hydratées un jour avant le test. Le jour du test, différents inhibiteurs sont injectés dans les orifices des cartouches de capteur en fonction des exigences du test, et un tampon d’étalonnage est ajouté à la plaque d’étalonnage de 96 puits. Après l’étalonnage, le test de flux métabolique cellulaire en temps réel est effectué, suivi de l’imagerie de la microplaque de culture cellulaire à l’aide de l’imageur de microplaques pour normaliser les données de l’analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel avec le nombre de cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Toutes les procédures étaient basées sur les directives et l’approbation du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université Vanderbilt. 1. Préparation des réactifs et configuration du test Isolement et culture des cellules stromales de la moelle osseuse (voir également l’article précédent30). Préparer un milieu de culture cellulaire alpha minimum complet (αMEM) en compl…

Representative Results

Figure 6 : Graphiques représentatifs des essais effectués régulièrement pour comprendre le profil bioénergétique cellulaire du groupe témoin par rapport au groupe de traitement avec leurs erreurs-types respectives. (A) Le test de phénotype de l’énergie cellulaire. Le graphique représente la glycolyse (ECAR) par ra…

Discussion

L’analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel peut être utilisé pour explorer l’énergie cellulaire dans différentes conditions. Le protocole illustre l’isolement efficace des BMSC, la culture des cellules dans des plaques de culture cellulaire appropriées et leur différenciation en ostéoblastes matures, qui peuvent être utilisés pour divers tests à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. En outre, les étapes critiques du test du flux métabolique cellulaire en temps réel, y compr…

Materials

0.25% Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid	Sigma – Aldrich	PZ0160	UK5099
Antimycin A	Sigma – Aldrich	A8674
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G
Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide	Sigma – Aldrich	SML0601	BPTES
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma – Aldrich	C2920	FCCP
Cytation 5 imaging reader	BioTek	N/A	Microplate imager
Etomoxir sodium salt hydrate	Sigma – Aldrich	E1905
Hoechst 33342 Solution (20 mM)	Thermo Scientific	62249
Insulin	Sigma – Aldrich	I6634
Oleic Acid-Albumin from bovine serum	Sigma – Aldrich	O3008
Oligomycin A – 5 mg	Sigma – Aldrich	75351
Rotenone	Sigma – Aldrich	R8875-1G
Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200mM Glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF DMEM media	Agilent Technologies	103575-100	DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent Technologies	S7800B	Real- Time Metabolic flux analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent Technologies	102416-100	Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution
The Cell imaging 1.1.0.11 software	Agilent Technologies – BioTek
Wave software 2.6.1	Agilent Technologies
β-glycerol phosphate	Sigma-Aldrich	G9422-50G