בדיקת כימוטקסיס משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפים ריזובקטריאליים באקסודות שורש
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקה כימוטקסיס משופר. מטרת פרוטוקול זה היא להפחית את הצעדים והעלויות של שיטות כימוטקסיס חיידקיות מסורתיות ולשמש משאב בעל ערך להבנת אינטראקציות בין צמחים למיקרובים.
Abstract
זיהוי Chemotaxis חשוב מאוד למחקר ויישום של חיידקים מקדמי צמיחה rhizosphere. הקמנו שיטה פשוטה כדי לזהות במהירות את הכימותרפיה שיכולה לגרום לתנועה כימוטקטית של חיידקים מקדמי צמיחה rhizosphere על שקופיות זכוכית סטריליות באמצעות צעדים פשוטים. תמיסת חיידקים (OD600 = 0.5) ותמיסה מימית כימותרפית סטרילית נוספו טיפה על מגלשת הזכוכית במרווח של 1 ס”מ. לולאה חיסונית שימשה לחיבור התמיסה המימית הכימותרפית לפתרון החיידקי. המגלשה נשמרה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות על הספסל הנקי. לבסוף, תמיסת מימית כימותרפית נאספה לספירת חיידקים ותצפית מיקרוסקופית. במחקר זה, באמצעות השוואות מרובות של תוצאות ניסיוניות, השיטה התגברה על חסרונות מרובים של שיטות כימוטקסיס חיידקיות מסורתיות. השיטה הפחיתה את השגיאה של ספירת הלוחות וקיצרה את מחזור הניסוי. לזיהוי חומרים כימותרפיים, שיטה חדשה זו יכולה לחסוך 2-3 ימים בהשוואה לשיטה המסורתית. בנוסף, שיטה זו מאפשרת לכל חוקר להשלים באופן שיטתי ניסוי כימוטקסיס חיידקי תוך 1-2 ימים. הפרוטוקול יכול להיחשב כמשאב בעל ערך להבנת אינטראקציות בין חיידקים צמחיים.
Introduction
Chemotaxis חשוב להתיישבות של ריזובקטריאל קידום צמיחה צמחית (PGPR) על שורשים ולהבנת אינטראקציות בין צמחים למיקרואורגניזמים1. סוג של תרכובות משקל מולקולרי נמוך (כימותרפיה) ב exudates שורש הצמח לגרום לתנועה כימוטקטית של PGPR כדי rhizosphere2. חומצה מאלית, חומצת לימון, ורכיבים אחרים exudates השורש לעורר chemotaxis של זני Bacillus3. לדוגמה, גלוקוז, חומצת לימון וחומצה פומרית באקסודות שורש תירס מגייסים חיידקים למשטח השורש4. D-גלקטוז, אשר נגזר exudates שורש, גורם כימוטקסיס של Bacillus velezensis SQR95. חומצות אורגניות, כולל פומראט, חומצה מאלית, ותמציתיות, משפיעות על כימוטקסיס והתיישבות של PGPR שונים במערכת הקג’אן – Zea mays intercropping6. חומצה אולאנולית באקסודטים שורש אורז, משמשת ככימותרפיה לזן FP357. אקסודטים צמחיים אחרים (כולל היסטידין, ארגינין ואספרטאט) יכולים למלא תפקיד מכריע בתגובה הכימית של חיידקים8. אקסודטים צמחיים מתפקדים כאות לכוון את תנועת החיידקים, שהיא הצעד הראשון במהלך קולוניזציה של ריזוספירה. קולוניזציה צמחית על ידי PGPR היא תהליך של רלוונטיות עצומה, כמו PGPR מועילים עבור המארח הצמח.
שיטות רבות שימשו לניתוח כימוטקסיס חיידקי. שיטת צלחת השחייה היא אחת השיטות שתוארו בעבר9. בשיטה זו, הצלחות נעשו עם מדיום חצי-סוליד. חיץ כימוטקטי המכיל אגר (1.0%, w/v) נוסף ללוח. החיץ מחומם, ולאחר מכן מעורבב עם chemoattractant. לאחר מכן, 8 μL של השעיית חיידקים נוספה dropwise לאמצע הצלחת ואת הצלחת הונחה באינקובטור ב 28 °C (60 °F). הצלחת נצפתה באופן קבוע וצולמה. עם זאת, המחזור הניסיוני של שיטת צלחת השחייה היה ארוך מאוד. בשיטה דמוית נימי10, קצה פיפטה משמש כתא להחזקת 100 μL של השעיה חיידקית. מחט מזרק 1 מ”ל שימשה כנימים. מחט מזרק המכילה כימותרפיה עם שיפועי ריכוז שונים הוכנסה לתוך קצה פיפטה 100 μL. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות, מחט המזרק הוסרה, התוכן היה מדולל מצופה על המדיום. הצטברות החיידקים במזרק יוצגה על ידי יחידות יוצרות מושבה (CFUs) בלוחות. עם זאת, השגיאה הניסיונית בתוך שכפולים עבור השיטה דמוית נימי היה גדול. שיטה אחרת השתמשה במכשיר SlipChip מיקרופלוידי11. בקצרה, פתרון אלבומין סרום בקר (BSA) הוזרק לכל הערוצים והוסר באמצעות ואקום. הפתרונות המכילים כימותרפיה שונים (ריכוז של 1 מ”מ לגילוי איכותי בלבד), תאי חיידקים המושעים מלוחים חוצצי פוספט ומאגר מלוחים עם מאגר פוספט (בקרה שלילית) נוספו למיקרווולים העליונים, האמצעיים והתחתונים, בהתאמה. הדגירה בוצעה אז בסביבה חשוכה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. תאי החיידקים התגלו אז במיקרווולים. מכשיר SlipChip המיקרופלוידי, לעומת זאת, היה יקר. לכן, לכל אחת מהשיטות שתוארו לעיל היו יתרונות וחסרונות.
הקמנו בדיקת כימוטקסי משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפיה rhizobacterial ב exudates שורש באמצעות שקופיות זכוכית סטריליות ללא צעדים מסובכים. במחקר זה, באמצעות השוואות מרובות של תוצאות ניסיוניות, השיטה התגברה על חסרונות מרובים של שיטות כימוטקסיס חיידקיות מסורתיות. השיטה הפחיתה את השגיאה של ספירת הלוחות וקיצרה את מחזור הניסוי. לכן, אם נעשה שימוש כדי לזהות חומר כימותרפי, שיטה חדשה זו יכולה לחסוך 2-3 ימים ולהפחית את העלות של חומרים ניסיוניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים הולכים וגוברים מצביעים על כך שאינטראקציות בין חיידקים צמחיים מתרחשות בעיקר בריזוספירה ומושפעות מאקסודטים שורשיים20,21,22,23,24. אקסודטים שורש צמח כוללים מגוון רחב של מטבוליטים ראשוניים, כולל חומצ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘31870493), פרויקטי המחקר והפיתוח העיקריים בהיילונגג’יאנג, סין (GA21B007), ודמי המחקר הבסיסיים של אוניברסיטאות במחוז היילונגג’יאנג, סין (מס ‘135409103).
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
Riferimenti
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).
- Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. Root exudates mediated interactions belowground. Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).
- Zhang, N., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains. Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).
- Zhang, N., et al. Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates. BMC Genomics. 16 (1), 685 (2015).
- Lui, Y., et al. Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).
- Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan – Zea mays intercropping system. Rhizosphere. 18 (12), 100331 (2021).
- Sampedro, I., et al. Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T. Microorganisms. 8 (4), 575 (2020).
- Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).
- Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere. European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Shen, C., et al. Bacterial chemotaxis on Slipchip. Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).
- Liu, H., et al. Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).
- Goswami, M., Deka, S. Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens. Microbiological Research. 240, 126516 (2020).
- Kaiira, M., Chemining’Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize. Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).
- Shi, Y., et al. Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans. African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).
- Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice. Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).
- Belimov, A. A., et al. Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum). Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).
- Ankati, S., Podile, A. R. Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner. Journal of Plant Physiology. 243, 153057 (2019).
- Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates. FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions. Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).
- Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).
- Kamilova, F., et al. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum. Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).
- Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates. Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).
