루트 엑수데이트에서 뿌리 균 화학 물질의 신속 한 식별에 대 한 향상 된 화학 분석
Summary
여기에서, 우리는 향상된 화학탁증 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 목표는 전통적인 세균 화학 요법 방법의 단계와 비용을 줄이고 식물 미생물 상호 작용을 이해하는 데 중요한 자원역할을하는 것입니다.
Abstract
화학 요법 식별은 뿌리 권 성장 촉진 박테리아의 연구 및 응용 프로그램에 매우 중요합니다. 간단한 단계를 통해 멸균 유리 슬라이드에서 뿌리 부속성 성장 촉진 박테리아의 화학적 움직임을 유도할 수 있는 화학 물질을 신속하게 식별하는 간단한 방법을 확립했습니다. 박테리아 용액(OD600 = 0.5) 및 멸균 화학 요법 수성 용액은 1cm 간격으로 유리 슬라이드에 드롭와이즈를 첨가하였다. 항분 루프는 화학 요법 수성 용액을 세균 용액에 연결하는 데 사용되었습니다. 슬라이드는 깨끗한 벤치에서 20 분 동안 실온에서 보관되었습니다. 마지막으로, 항암제 수성 용액은 세균계 수분 및 현미경 관찰을 위해 수집되었다. 이 연구에서는 실험 결과의 여러 비교를 통해, 방법은 전통적인 세균성 화학 요법 방법의 여러 단점을 극복. 이 방법은 플레이트 계수의 오류를 줄이고 실험 주기를 단축시켰다. 화학 물질의 식별을 위해,이 새로운 방법은 기존의 방법에 비해 2-3 일을 절약 할 수 있습니다. 추가적으로, 이 방법은 어떤 연구원든지 체계적으로 1-2 일 안에 세균성 화학 요법 실험을 완료하는 것을 허용합니다. 프로토콜은 식물 세균 상호 작용을 이해하기 위한 귀중한 자원으로 간주될 수 있습니다.
Introduction
화학 요법은 뿌리에 식물 성장 촉진 뿌리 균 (PGPR)의 식민지화에 중요 하고 식물-미생물 상호 작용을 이해 1. 식물 뿌리 에서 저분자 화합물 (화학 요법제)의 클래스는 뿌리 부각에 PGPR의 화학 운동을 유도2. 말산, 구연산 및 뿌리 의 다른 성분은 바실러스 균주의 화학 을 자극3. 예를 들어, 옥수수 뿌리에서 포도당, 구연산 및 fumaric 산은 뿌리 표면에 박테리아를 모집4. D-갈라콘토제는 뿌리 에서 유래되어 바실러스 벨레젠시스 SQR95의 화학요법을 유도한다. 유기 산, fumarate를 포함 하 여, 기이 한 산, 그리고 간결, 화학 요법및 카자누스 카잔에서 다양 한 PGPR의 식민지에 영향을 – 제아는 교차 크롭 시스템 6 수 있습니다. 쌀 뿌리에서 올레아놀산은 변속, 변형 FP357에 대한 화학 작용의 역할을 한다. 다른 식물 이출 (히스티딘 포함, 아르기닌, 및 아스파르타트) 박테리아의 화학 반응에 중요 한 역할을 할 수 있습니다8. 식물은 뿌리 권 식민지 동안 첫 번째 단계인 박테리아의 움직임을 지시하는 신호로서의 기능을 추방한다. PGPR에 의한 식물 식민지는 엄청난 관련성의 과정입니다, PGPR은 식물 호스트에 도움이 되기 때문에.
세균 성 화학 요법을 분석하는 데 많은 방법이 사용되었습니다. 상기 수영플레이트 방법은 이전에 설명된 방법 중 하나입니다9. 이 방법에서 플레이트는 반고체 배지로 만들어졌습니다. 한천(1.0%, w/v)을 함유한 화학완충제가 플레이트에 첨가되었다. 버퍼는 가열된 다음 화학 요법자와 혼합됩니다. 이어서, 8μL의 박테리아 현탁액은 플레이트의 중간에 드롭와이즈로 첨가되었고 플레이트는 28°C에서 인큐베이터에 배치되었다. 접시는 정기적으로 관찰되고 촬영되었습니다. 그러나, 수영 플레이트 방법의 실험 주기는 매우 길다. 모세관과 같은 방법10에서, 파이펫 팁은 세균 현탁액의 100 μL을 보유하기위한 챔버 역할을한다. 1 mL 주사기 바늘은 모세관으로 사용되었다. 다른 농도 그라데이션을 가진 화학 물질을 포함하는 주사기 바늘을 100 μL 파이펫 팁에 삽입했습니다. 3시간 동안 실온에서 배양한 후, 주사기 바늘을 제거하고, 함량을 희석시키고 배지상에 도금하였다. 주사기의 세균 축적은 플레이트내의 식민지 형성 단위(CfU)로 표현되었다. 그러나 모세관과 같은 방법에 대한 복제 내의 실험 오차는 컸다. 또 다른 방법은 미세 유체 슬립 칩 장치를 사용했다11. 간략하게, 소 혈청 알부민 (BSA) 용액은 모든 채널에 주입하고 진공을 사용하여 제거되었다. 상이한 화학요법제(질적 검출을 위한 1mM 농도),인산완충식염 및 인산염 완충식식염 버퍼링식 염선 버퍼(음성 대조군)에서 중단된 세균세포(음의 대조군)를 각각 상부, 중간 및 하부 마이크로웰에 첨가하였다. 인큐베이션은 30분 동안 실온에서 어두운 환경에서 수행되었다. 세균성 세포는 마이크로웰에서 그 때 검출되었습니다. 그러나 미세유체 슬립칩 장치는 비용이 많이 들었습니다. 따라서, 상술한 각 방법은 장점과 단점이 있었다.
복잡한 단계 없이 멸균 유리 슬라이드를 사용하여 뿌리 에서 뿌리 줄기균 화학 요법의 신속한 식별을 위한 개선된 화학요법 분석법을 확립했습니다. 이 연구에서는 실험 결과의 여러 비교를 통해, 방법은 전통적인 세균성 화학 요법 방법의 여러 단점을 극복. 이 방법은 플레이트 계수의 오류를 줄이고 실험 주기를 단축시켰다. 따라서, 화학 물질을 식별하는 데 사용되는 경우, 이 새로운 방법은 2-3 일을 절약하고 실험 재료의 비용을 줄일 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
증가 연구는 식물 박테리아 상호 작용이 주로 뿌리 에서 발생 하 고 루트 exudates20,21,22,23,24에 의해 영향을 나타냅니다. 식물 뿌리 이출은 페놀산, 유기산 및 아미노산뿐만 아니라 더 복잡한 이차 화합물25,26,27을 포함한 다?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립자연과학재단(31870493, 중국 헤이룽장의 주요 연구개발 프로젝트(GA21B007), 중국 헤이룽장성 대학의 기초연구료(제1호 135409103)가 지원했다.
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
Riferimenti
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