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Biochemistry

Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63260
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, dans ce protocole, une stratégie modifiée de purification d’affinité et de compétition a été développée pour purifier le canal endogène TRP de la drosophile .

Abstract

La phototransduction de la drosophile est l’une des voies de signalisation couplées à la protéine G les plus rapides connues. Pour assurer la spécificité et l’efficacité de cette cascade, le canal cationique perméable au calcium (Ca2+), le potentiel récepteur transitoire (TRP), se lie étroitement à la protéine de l’échafaudage, l’inactivation sans potentiel Après potentiel D (INAD), et forme un grand complexe protéique de signalisation avec la protéine kinase C (ePKC) spécifique à l’œil et le potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA). Cependant, les propriétés biochimiques du canal TRP de la drosophile restent floues. Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, une purification d’affinité modifiée et une stratégie de compétition ont été développées pour purifier le canal endogène TRP. Tout d’abord, le fragment NORPA 863-1095 purifié marqué à l’histidine (His) a été lié à des perles de Ni et utilisé comme appât pour extraire le complexe protéique endogène de l’INAD des homogénats de tête de drosophile. Ensuite, un fragment TRP 1261-1275 purifié excessif marqué par la glutathion S-transférase (GST) a été ajouté aux perles de Ni pour concurrencer le canal TRP. Enfin, le canal TRP dans le surnageant a été séparé du peptide TRP 1261-1275 excessif par chromatographie d’exclusion de taille. Cette méthode permet d’étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP de la drosophile sous des angles biochimiques et structurels. Les propriétés électrophysiologiques des canaux TRP purifiés de la drosophile peuvent également être mesurées à l’avenir.

Introduction

La phototransduction est un processus où les photons absorbés sont convertis en codes électriques des neurones. Il relaie exclusivement les opsines et la cascade de signalisation couplée à la protéine G suivante chez les vertébrés et les invertébrés. Chez la drosophile, en utilisant ses cinq domaines PDZ, l’inactivation de la protéine d’échafaudage sans potentiel postérieur D (INAD) organise un complexe de signalisation supramoléculaire, qui se compose d’un canal de potentiel de récepteur transitoire (TRP), de potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA) et d’une protéine kinase C (ePKC)1 spécifique à l’œil. La formation de ce complexe de signalisation supramoléculaire garantit la localisation subcellulaire correcte, une efficacité élevée et la spécificité de la machinerie de phototransduction de la drosophile. Dans ce complexe, les canaux TRP sensibles à la lumière agissent comme des effecteurs en aval de NORPA et médient l’afflux de calcium et la dépolarisation des photorécepteurs. Des études antérieures ont montré que l’ouverture du canal TRP de la drosophile est médiée par les protons, la perturbation de l’environnement lipidique local ou la force mécanique 2,3,4. Le canal TRP de la drosophile interagit également avec la calmoduline5 et est modulé par le calcium par rétroaction positive et négative 6,7,8.

Jusqu’à présent, les études d’électrophysiologie sur le mécanisme de contrôle des canaux TRP et TRP-like (TRPL) de la drosophile étaient basées sur des patchs membranaires excisés, des enregistrements de cellules entières de photorécepteurs dissociés de type sauvage de la drosophile et des canaux hétéro-exprimés dans les cellulesS2, SF9 ou HEK 2,9,10,11,12,13, mais pas sur les canaux purifiés. Les informations structurelles du canal TRP complet de la drosophile restent également floues. Afin d’étudier les propriétés électrophysiologiques des protéines purifiées dans un environnement membranaire reconstitué et d’obtenir des informations structurelles sur le canal TRP de drosophile sur toute la longueur, l’obtention de canaux TRP purifiés sur toute la longueur est la première étape nécessaire, similaire aux méthodologies utilisées dans les études des canaux TRP des mammifères 14,15,16,17.

Récemment, sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD 18,19,20, une stratégie de purification d’affinité et de compétition a d’abord été développée pour purifier le canal TRP des homogénats de tête de drosophile par des billes de streptavidine 5. Compte tenu de la faible capacité et du coût élevé des perles de streptavidine, un protocole de purification amélioré est introduit ici qui utilise la protéine d’appât marquée His et les perles Ni correspondantes à faible coût avec une capacité beaucoup plus élevée. La méthode proposée aidera à étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP sous des angles structurels et à mesurer les propriétés électrophysiologiques du canal TRP avec des protéines purifiées.

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Protocol

1. Purification du TRP étiqueté GST et des fragments NORPA étiquetés His

  1. Purifier le fragment TRP 1261-1275 étiqueté TPS
    1. Transformez le plasmide10 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 en cellules Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) à l’aide de la méthode de transformation par choc thermique CaCl2 21. Inoculer une seule colonie dans 10 mL de milieu Luria Bertani (LB) et croître pendant la nuit à 37 °C. Ensuite, amplifier les 10 mL de culture d’ensemencement dans 1 L de milieu LB à 37 °C.
    2. Une fois que la densité optique (OD600) des cellules atteint 0,5, refroidir les cellules à 16 °C et ajouter 0,1 mM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; concentration finale) pour induire la surexpression de la protéine cible et incuber à 16 °C pendant 18 h.
    3. Après surexpression, pastille 1 L de cellules cultivées par centrifugation à 3 993 × g pendant 20 min et remettre en suspension dans 40 mL de tampon salin tamponné au phosphate (PBS).
    4. Chargez les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur haute pression pré-refroidi à 4 °C. Augmentez lentement la pression de l’homogénéisateur à 800 bars. Ouvrez le robinet d’entrée et laissez les cellules remises en suspension passer circulairement à travers une vanne à fentes très étroites.
      REMARQUE: Les cellules sont homogénéisées par les forces de cisaillement élevées causées par une chute de pression et une cavitation importantes.
    5. Chargez 5 mL de billes de glutathion dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez les billes avec 50 mL de tampon PBS pour un total de trois fois.
    6. Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48 384 x g. Ajouter le surnageant du lysat de cellule centrifugée (40 mL) aux billes de glutathion équilibrées dans la colonne d’écoulement gravitaire et incuber pendant 30 min à 4 °C. Remettez en suspension les perles de glutathion toutes les 10 minutes.
    7. Après 30 min d’incubation, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement. Jetez la fraction d’écoulement. Rincez deux fois les billes de glutathion restantes avec 50 mL de tampon PBS.
    8. Ajouter 15 mL de tampon d’élution aux billes de glutathion et incuber pendant 30 min. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.
    9. Après 30 min d’incubation, éluez le fragment TRP 1261-1275 marqué GST dans un tube conique de 50 mL et chargez-le dans une colonne d’exclusion de taille (grade de préparation), qui est équilibré à l’aide d’un tampon Tris de 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    10. Maintenir le débit d’élution de la colonne d’exclusion de taille à 3 mL/min. Recueillir les protéines éluées à raison de 5 mL/tube.
    11. Identifier le pic de la protéine cible dans la colonne d’exclusion de taille en analysant les signaux d’absorption UV à 280 nm et vérifier par analyse de gel SDS-PAGE (paramètres d’électrophorèse : 150 V pour le gel empilable ; 200 V pour le gel résolvant). Tachez le gel avec coomassie bleu R250.
    12. Concentrer le fragment purifié TRP 1261-1275 marqué GST de la colonne d’exclusion de taille à 1 mL à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 15 mL centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée de bureau.
    13. Déterminer la concentration de protéines concentrées à l’aide de la loi de Beer-Lambert. Mesurez l’absorption UV du fragment TRP 1261-1275 marqué GST à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
    14. Obtenir le coefficient d’extinction à 280 nm en important les séquences protéiques dans le programme Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). En règle générale, la culture de 1 L de TRP 1261-1275 marqué GST donne 1 mL de 600 μM de protéines (6 x 10-7 mol). Voir le tableau 1 pour les matériaux nécessaires.
  2. Purification du fragment NORPA 863-1095 étiqueté His
    1. Transformer le plasmide20 pETM.3C NORPA 863-1095 en cellules E. coli BL21 (DE3) à l’aide de la méthode de transformation par choc thermique CaCl2 21. Inoculer une seule colonie dans 10 mL de milieu LB et croître pendant la nuit à 37 °C. Ensuite, amplifier la culture d’ensemencement de 10 mL dans 1 L de milieu LB à 37 °C.
    2. Une fois que la DO600 des cellules atteint 0,5, refroidir les cellules à 16 °C et ajouter 0,1 mM d’IPTG (concentration finale) pour induire la surexpression de la protéine cible et incuber à 16 °C pendant 18 h.
    3. Après surexpression, pastille 1 L de cellules cultivées par centrifugation à 3 993 x g pendant 20 min et remise en suspension dans 40 mL de tampon de liaison. Ensuite, lyser les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur à haute pression à 4 °C comme décrit à l’étape 1.1.4.
    4. Chargez 5 mL de billes de Ni dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez trois fois avec 50 mL de tampon de liaison.
    5. Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48 384 x g. Ajouter le surnageant du lysat de cellule centrifugée aux billes de Ni équilibrées dans la colonne d’écoulement par gravité et incuber pendant 30 min à 4 °C. Resuspendez les perles de Ni toutes les 10 minutes.
    6. Après 30 min d’incubation, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement. Jetez la fraction d’écoulement et lavez les billes de Ni restantes deux fois avec 50 mL de tampon de lavage.
    7. Ajouter 15 mL de tampon d’élution aux ni-billes et incuber pendant 30 min. Resuspendez les perles de Ni toutes les 10 minutes.
    8. Après 30 min d’incubation, recueillir le fragment NORPA 863-1095 marqué His élué dans un tube conique de 50 mL et charger dans une colonne d’exclusion de taille (grade de préparation), qui est équilibrée à l’aide de Tris de 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    9. Maintenir le débit d’élution de la colonne d’exclusion de taille à 3 mL/min. Recueillir la protéine éluée à raison de 5 mL/tube.
    10. Identifier le pic de la protéine cible dans la colonne d’exclusion de taille en analysant les signaux d’absorption UV à 280 nm et vérifier par analyse de gel SDS-PAGE (paramètres d’électrophorèse : 150 V pour le gel empilable ; 200 V pour le gel résolvant). Tassez le gel à l’aide de Coomassie bleu R250.
    11. Concentrer le fragment NORPA 863-1095 purifié de la colonne d’exclusion de taille à 1 mL à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 15 mL centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée de bureau.
    12. Déterminer la concentration de protéines concentrées à l’aide de la loi de Beer-Lambert. Mesurez l’absorption UV du fragment NORPA 863-1095 marqué his à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
    13. Obtenir le coefficient d’extinction à 280 nm en important les séquences protéiques dans le programme Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Typiquement, la culture de 1 L du fragment NORPA 863-1095 marqué par His donne 1 mL de 600 μM de protéine (6 x 10-7 mol). Voir le tableau 2 pour les matériaux nécessaires.

2. Préparation des têtes de drosophiles

  1. Recueillir les mouches adultes dans des tubes de centrifugation conique de 50 mL à l’aide de la méthode d’anesthésie au CO2 22,23; congeler immédiatement dans de l’azote liquide pendant 10 min et conserver dans un congélateur à -80°C.
  2. Après avoir recueilli un nombre suffisant de mouches, secouez vigoureusement les tubes coniques congelés de 50 mL à la main pour séparer les pattes, la tête, les ailes et le corps des mouches. Transférer le mélange dans trois tamis en acier inoxydable pré-refroidis séquentiellement (maillage 20/30/40, respectivement) et agiter les tamis.
  3. Ensuite, comme les têtes ne peuvent pas passer à travers le tamis à 40 mailles, utilisez une brosse pour balayer les têtes de mouche du tamis à 40 mailles, transférez-les dans des tubes coniques de 50 mL et stockez-les à −80 °C.
  4. Recueillir en permanence les mouches et leurs têtes et les stocker dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent la quantité requise pour l’expérimentation (0,5 g). En règle générale, pour recueillir 0,5 g de têtes, 35 mL de mouches dans un tube conique de 50 mL sont nécessaires. Voir le tableau 3 pour les matériaux nécessaires.

3. Purification du canal TRP de la drosophile

  1. Peser un total de 0,5 g de têtes et homogénéiser complètement dans l’azote liquide à l’aide d’un pilon de mortier pré-refroidi. Dissoudre les têtes homogénéisées dans un tampon de lyse de 10x v/w (5 mL), incuber dans un agitateur à 4 °C pendant 20 min, puis centrifuger à 20 817 x g pendant 20 min à 4 °C.
  2. Recueillir le surnageant de spin-down (« 20817 g S », Figure 4) et le centrifuger à 100 000 x g pendant 60 min à 4 °C. Utilisez le surnageant de rotation (« 100 000 g S », figure 4) pour le test de traction suivant.
  3. Ajouter 1 mL de billes de Ni dans la colonne d’écoulement par gravité et laver les billes avec 10 mL deH2O(ddH2O) double distillé à 4 °C pour un total de trois fois. Équilibrer les billes avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse trois fois à 4 °C.
  4. Ajouter 500 μL de 600 μM de protéine NORPA 863-1095 purifiée marquée His-1095 (3 x 10-7 mol) dans la colonne Ni et incuber pendant 30 min à 4 °C. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.
  5. Ouvrez le robinet de sortie de la colonne pour séparer les perles et la fraction de flux. Prenons la fraction de flux pour l’analyse SDS-PAGE (NORPA F, Figure 4). Dans cette section, les protéines d’appât sont immobilisées sur les perles de Ni.
  6. Lavez les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse (10 mL) à 4 °C et conservez la fraction de lavage pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 1, Figure 4A). Répétez les étapes ci-dessus et conservez l’échantillon pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 2, Figure 4A). Dans cette section, les protéines d’appât excessives sur les perles de Ni sont éliminées.
  7. Ajouter le surnageant de l’homogénat de tête de drosophile après centrifugation de 100 000 x g dans la colonne Ni à 4 °C, où le fragment NORPA 863-1095 marqué par His a été immobilisé.
  8. Incuber le surnageant avec les perles de Ni à 4 °C pendant 30 min. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes. Ensuite, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement.
  9. Recueillir le surnageant pour l’analyse SDS-PAGE (lyse de tête Dro F, Figure 4A). Dans cette section, les complexes protéiques INAD (INAD/TRP/ePKC) dans les homogénats de tête sont capturés par les fragments NORPA 863-1095 immobilisés sur les ni-billes.
  10. Laver les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse (10 mL) à 4 °C et garder le surnageant des précipitations par gravité pour l’analyse SDS-PAGE (Wash 3, Figure 4A). Répétez les étapes ci-dessus et collectez le surnageant pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 4, Figure 4A). Dans cette section, les protéines non liées sur les perles de Ni sont éliminées.
  11. Ajouter 500 μL de 600 μM de protéine TRP 1261-1275 marquée GST (3 x 10-7 mol) dans les billes de Ni et incuber pendant 20 min à 4 °C. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.
  12. Recueillir la fraction éluée de la colonne de gravité (TRP E1, Figure 4B), qui contient le canal endogène Drosophila TRP. Répétez les étapes ci-dessus et collectez la fraction d’élution (TRP E2, Figure 4B). Dans cette étape, en utilisant les fragments TRP 1261-1275 marqués GST comme concurrent, les canaux TRP sont élués à partir des complexes protéiques INAD capturés (INAD / TRP / ePKC) sur les perles Ni.
  13. Laver les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de liaison (10 mL; Tableau 1) à 4 °C et recueillir la fraction de lavage pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 5, Figure 4B).
  14. Ajouter 500 μL de tampon d’élution (tableau 1) dans les billes de Ni et incuber pendant 20 min à 4 °C. Recueillir la fraction d’élution de la colonne d’écoulement gravitaire (NORPA E1, figure 4B). Répétez les étapes ci-dessus et collectez la fraction d’élution (NORPA E2, Figure 4B).
  15. À l’aide du tampon d’élution, éluez le fragment NORPA 863-1095 marqué His accompagné des complexes protéiques INAD/ePKC. Ensuite, remettez en suspension les billes de Ni dans 500 μL de tampon de liaison.
  16. Prenez les billes de Ni remises en suspension pour exécuter la SDS-PAGE (colorée par Coomassie bleu R250) afin d’analyser l’efficacité de l’élution et d’évaluer si le tampon d’élute fonctionne (perles, Figure 4B). Voir le tableau 4 pour les matériaux nécessaires.

4. Purification de la colonne d’exclusion de taille du canal TRP de la drosophile

  1. Installez une colonne d’exclusion de taille (grade analytique) sur le système de purification des protéines. Équilibrez la colonne avec le tampon de colonne (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), qui est filtré par un filtre de 0,45 μm.
  2. Concentrer la fraction TRP E1 et E2 de l’étape 3.14 à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 4 mL, centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée.
  3. Rincez la boucle d’échantillon avec le tampon de colonne et chargez l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage. Injecter l’échantillon dans la colonne d’exclusion de taille et éluer les protéines avec un débit approprié (0,5 mL/min).
  4. Identifier le pic de la protéine cible par absorption à 280 nm et exécuter un gel SDS-PAGE pour détecter le canal endogène purifié de la Drosophile TRP (Figure 5). Voir le tableau 5 pour les matériaux nécessaires.

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Representative Results

Dans cet article, il est démontré qu’une méthode de purification des protéines purifie le canal endogène TRP de la drosophile (Figure 1).

Tout d’abord, l’expression et la purification des protéines recombinantes sont appliquées pour obtenir les protéines d’appât et concurrentes. Ensuite, un fragment TRP 1261-1275 marqué GST est exprimé dans des cellules E. coli BL21 (DE3) en milieu LB et purifié à l’aide de billes de glutathion et d’une colonne d’exclusion de taille (Figure 2). Les échantillons ont été vérifiés à l’aide de l’analyse SDS-PAGE avec coloration bleu Coomassie R250. Dans le processus de préparation de l’échantillon SDS-PAGE, 30 μL d’échantillon de protéine sont mélangés à 10 μL de colorant à charge 4x et bouillis à 100 °C pendant 10 min. Ensuite, 15 μL d’échantillon bouilli sont chargés individuellement dans chaque puits. Le fragment NORPA 863-1095 marqué par His est également exprimé de manière similaire dans les cellules E. coli BL21 (DE3) en milieu LB et purifié par des perles de Ni et une colonne d’exclusion de taille (Figure 3). Le TRP 1261-1275 purifié marqué GST et le NORPA 863-1095 étiqueté His sont concentrés pour la purification du canal endogène TRP de la drosophile .

Deuxièmement, les têtes de drosophiles sont collectées et homogénéisées dans de l’azote liquide à l’aide d’un pilon de mortier pré-refroidi, puis dissoutes dans un tampon de lyse de 10x v/p (tableau 4). L’homogénat de tête dissoute est incubé dans un agitateur à 4 °C pendant 20 min et centrifugé à 20 817 x g pendant 20 min à 4 °C. Le surnageant de spin-down (20817 g S, Figure 4A) est collecté et centrifugé à 100 000 x g pendant 60 min à 4 °C. Le deuxième surnageant de spin-down (100 000 g S, Figure 4A) est utilisé pour le test de traction ultérieur.

Enfin, sur la base des principes du pull-down et du test de compétition, la stratégie de purification d’affinité et de compétition est utilisée pour purifier le canal TRP endogène. Le fragment NORPA 863-1095 purifié marqué par His est lié aux perles de Ni et utilisé comme appât pour extraire les complexes protéiques endogènes de l’INAD des homogénats de tête de drosophile . Ensuite, un fragment de TRP 1261-1275 purifié excessif marqué GST est ajouté pour concurrencer le canal TRP des complexes INAD capturés sur les perles Ni (TRP E1, TRP E2, Figure 4B). En fin de compte, le canal TRP élué est séparé du peptide TRP 1261-1275 marqué GST excessif par chromatographie d’exclusion de taille (Figure 5). Dans le processus de préparation de l’échantillon SDS-PAGE, 30 μL d’échantillon de protéine sont mélangés à 10 μL de colorant à charge 4x et bouillis à 100 °C pendant 10 min. Ensuite, les 15 μL d’échantillon sont chargés individuellement dans chaque puits. En tant que sous-produit, les complexes INAD-ePKC-NORPA 863-1095 peuvent également être obtenus en éluant les ni-billes après la compétition peptidique TRP 1261-1275 (NORPA E1, NORAP E2, Figure 4B). En utilisant cette méthode, le rendement typique du canal TRP purifié final de la drosophile à partir de têtes de mouche de 0,5 g est de 50 μL de protéine TRP de 3 μM (1,5 x 10-10 mol). Si davantage de canaux TRP purifiés sont nécessaires, augmentez la quantité de têtes de mouche, de perles de Ni, de protéines d’appât et de concurrents en conséquence.

Figure 1
Figure 1 : Schéma pour la purification du canal TRP endogène de la drosophile. (A) Les protéines NORPA 863-1095 purifiées marquées his-1095 sont immobilisées sur les perles de Ni. (B) Les têtes de drosophiles sont homogénéisées et le surnageant de spin-down après centrifugation de 100 000 x g est ajouté aux nibilles liées au NORPA, où la protéine NORPA 863-1095 agit comme appât pour capturer les complexes protéiques endogènes du PERN (INAD/TRP/ePKC). (C) Le fragment TRP 1261-1275 marqué GST est ajouté pour concurrencer le canal TRP endogène de la drosophile à partir des complexes protéiques INAD capturés. (D) La protéine TRP éluée est ensuite purifiée par une colonne d’exclusion de taille pour séparer le fragment TRP 1261-1275 marqué de la TPS. Les flèches rouges mettent en évidence les positions d’élution du canal TRP et du fragment TRP 1261-1275 marqué GST, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Purification de la protéine TRP-CT 1261-1275 marquée GST par des billes de glutathion et chromatographie d’exclusion de taille. (A) Profil de purification de la protéine TRP-CT 1261-1275 marquée GST dans une colonne d’exclusion de taille (grade de préparation). Les fractions sont collectées à 5 mL/tube. Les fractions à la position de la flèche (tubes 44-48) sont collectées et concentrées pour la purification suivante du canal endogène TRP. (B) Gel SDS-PAGE taché de R250 bleu coomassie montrant le fragment TRP 1261-1275 marqué GST dans la purification d’affinité des billes de glutathion et la purification ultérieure de la colonne d’exclusion de taille. La flèche met en évidence la position du fragment TRP 1261-1275 étiqueté TPS dans le gel SDS-PAGE. Abréviations : P : granulé d’E. coli. Lysat cellulaire BL21 (DE3) après homogénéisation dans le tampon PBS et centrifugation à 48 384 x g; S : surnageant d’E. coli. Lysat cellulaire BL21 (DE3) après homogénéisation et centrifugation à 48 384 x g; F: fraction d’écoulement après la fraction S précédente incubée avec des billes de glutathion pendant 30 min à 4 °C; W1 et W2 : la première et la deuxième fraction de lavage par 10 volumes de colonne de tampon PBS ; B: La protéine non éluée sur les billes de glutathion remises en suspension est analysée par le gel SDS-PAGE pour évaluer l’efficacité de l’élution; E : fraction d’élution des perles de glutathion par tampon d’élution. La recette tampon pour la purification des protéines marquée par la TPS est décrite dans le tableau 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Purification de la protéine NORPA 863-1095 marquée par His par des billes de Ni et chromatographie d’exclusion de taille. (A) Profil de purification de la protéine NORPA 863-1095 marquée his dans une colonne d’exclusion de taille. Débit = 3 mL/min. Les fractions sont collectées à 5 mL/tube. Les fractions à la position de la flèche (tubes 44-49) sont collectées et concentrées pour la purification suivante du canal endogène TRP. (B) Gel SDS-PAGE taché R250 bleu De Coomassie montrant la protéine NORPA 863-1095 marquée His dans la purification de la colonne Ni et la purification ultérieure de la colonne d’exclusion de taille. La flèche met en évidence la position de la protéine NORPA 863-1095 marquée his dans le gel SDS-PAGE. Abréviations : P : granulé d’E. coli. Lysat cellulaire BL21 (DE3) après homogénéisation dans le tampon de liaison et centrifugation à 48 384 x g; S : fraction surnageante d’E. coli. Lysat cellulaire BL21 (DE3) après homogénéisation et centrifugation à 48 384 x g; F: fraction d’écoulement après que la fraction S précédente est incubée avec des billes de Ni pendant 30 min à 4 °C; W1 et W2: la première et la deuxième fraction de lavage par 10 volumes de colonne de tampon de lavage; B: Protéine non éluée sur les perles de Ni remises en suspension après l’élution; E : fractions d’élution des perles de Ni par le tampon d’élution. La recette tampon pour la purification des protéines marquées His est répertoriée dans le tableau 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Purification du canal endogène de la Drosophile TRP. Les échantillons prélevés à chaque étape sont analysés par SDS-PAGE et colorés avec du colorant Coomassie bleu R-250. (A) 20817 g S: fraction surnageante des homogénats de tête après centrifugation de 20,817 x g; NORPA F : fraction fluide des perles ni après liaison de fragments NORPA 863-1095 marquée par His ; Wash1 et Wash2 : les première et deuxième fractions de lavage des billes de Ni par tampon de lyse après la liaison NORPA 863-1095 marquée de His ; 100 000 g S: le surnageant précédent de 20 817 g S est ensuite centrifugé à 100 000 x g et le surnageant est collecté pour SDS-PAGE; Lyse de la tête Dro F: fraction d’écoulement des billes de Ni après incubation avec l’échantillon S de 100 000 g; Wash3 et Wash4 : lavage des fractions de ni-billes par tampon de lyse après incubation avec un échantillon de 100 000 g de S. B) TRP E1 et E2 : les première et deuxième fractions de canal TRP éluées par fragment TRP 1261-1275 marqué GST; Lavage5 : lavage des fractions de ni-billes par tampon de liaison après concurrence par TRP 1261-1275 étiqueté gST; NORPA E1 et E2 : la première et la deuxième fraction d’élution des fragments NORPA 863-1095 marqués par His avec des complexes INAD/ePKC capturés ; perles: protéine non éluée restant dans les perles de Ni mises en suspension après le traitement tampon d’élution. La recette tampon pour la purification endogène du canal TRP de la drosophile est décrite dans le tableau 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Purification de la protéine endogène du canal TRP de la drosophile par chromatographie d’exclusion de taille. (A) Profil de purification de la protéine endogène du canal TRP de la drosophile dans la colonne d’exclusion de taille. Débit = 0,5 mL/min. Les fractions ont été recueillies à 0,5 mL/tube. Les fractions à la position de la flèche (1E8-1F2) ont été collectées et concentrées. (B) Gel SDS-PAGE coloré R-250 bleu de Coomassie montrant la protéine endogène du canal TRP de la drosophile après purification de la colonne d’exclusion de taille. La position de la protéine endogène purifiée du canal TRP de la drosophile est mise en évidence par la flèche rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Matériaux nécessaires à la purification du fragment TRP 1261-1275 étiqueté TPS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Matériaux nécessaires à la purification du fragment NORPA 863-1095 étiqueté His. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3: Matériel nécessaire à la préparation des têtes de drosophiles . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4: Matériaux nécessaires à la purification du canal TRP de la drosophile. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5: Matériaux nécessaires à la purification de la colonne d’exclusion de taille du canal TRP de la drosophile. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

INAD, qui contient cinq domaines PDZ, est le principal organisateur des machines de phototransduction de la drosophile. Des études antérieures ont montré que INAD PDZ3 se lie à la queue C-terminale du canal TRP avec une spécificité exquise (KD = 0,3 μM)18. Le tandem INAD PDZ45 interagit avec le fragment NORPA 863-1095 avec une affinité de liaison extrêmement élevée (KD = 30 nM). Ces résultats fournissent une base biochimique solide pour concevoir la stratégie de purification d’affinité et de compétition, qui permet au fragment NORPA CC-PBM d’être utilisé comme appât de traction, tandis que la queue terminale C TRP (fragment 1261-1275) fonctionne comme un réactif compétitif. Par conséquent, le premier point critique pour cette méthode est de comprendre le mécanisme d’assemblage du complexe INAD et d’obtenir suffisamment de fragments NORPA et TRP. Dans le même temps, puisque le canal TRP est la protéine membranaire qui doit être extraite de la membrane et stabilisée en solution, l’utilisation de détergent est le deuxième point critique de cette méthode. En tant que détergent populaire pour les études structurelles et fonctionnelles des canaux TRP 24,25, le n-dodécyl-B-D-maltoside (DDM) est utilisé dans cette méthode. Si les résultats de purification ne sont pas satisfaisants, les qualités de la protéine d’appât, de la protéine concurrente et du détergent doivent être vérifiées avec soin. De plus, l’efficacité d’extraction des canaux TRP peut être tracée par transfert Western à l’aide de l’anticorps TRP.

Dans une étude précédente5, des billes de streptavidine coûteuses ont été utilisées pour purifier le canal TRP des extraits de tête de mouche, ce qui limite la purification de routine en laboratoire. Par conséquent, la méthode a été améliorée en utilisant un fragment NORPA 863-1095 étiqueté His couplé à des perles de Ni pour réduire les coûts et augmenter le rendement. Actuellement, les rendements du canal TRP purifié dans la méthode améliorée sont suffisants pour mener une expérience de coloration négative au microscope électronique à transmission (TEM), dans laquelle les canaux TRP purifiés forment des tétramères (données non présentées), indiquant que le processus de purification ne perturbe pas la formation de tétramères des canaux TRP. Par conséquent, ce protocole sera potentiellement adapté aux futures expériences de cryo-EM et d’électrophysiologie.

Cependant, étant donné que les concurrents utilisés dans les expériences (fragment NORPA 863-1095, fragment TRP 1261-1275) ont des affinités de liaison similaires avec les protéines de type sauvage, la limitation de cette méthode est que des protéines et des billes compétitives massives doivent être utilisées pour abattre la protéine cible. Ce ne sera pas pratique pour les laboratoires qui ne peuvent pas purifier l’appât à grande échelle.

Une application future potentielle de cette méthode sera d’étudier l’information structurelle du canal TRP de la drosophile à l’aide de techniques Cryo-EM. En outre, il est également possible de mesurer les propriétés électrophysiologiques des canaux endogènes purifiés de TRP dans la membrane lipidique bicouche artificielle. De plus, dans ce système modèle reconstitué, il sera intéressant de caractériser les propriétés électrophysiologiques des canaux endogènes purifiés TRP en modulant la composition complexe INAD et la composition lipidique. Enfin, combinés aux informations structurelles et aux propriétés électrophysiologiques, les mécanismes de contrôle et de régulation du canal TRP peuvent être soigneusement examinés à l’avenir.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (n° 31870746), shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) et natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2021A1515010796) à W. L. Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son assistance linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

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References

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Biochimie numéro 178 purification des protéines drosophile canal TRP INAD
Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de <em>la drosophile</em>
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Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

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