Summary
Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, en este protocolo, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno Drosophila TRP.
Abstract
La fototransducción de Drosophila es una de las vías de señalización acopladas a proteínas G más rápidas conocidas. Para asegurar la especificidad y eficiencia de esta cascada, el canal catiónico permeable al calcio (Ca2+), el potencial del receptor transitorio (TRP), se une estrechamente a la proteína del andamio, inactivación-no-post-potencial D (INAD), y forma un gran complejo proteico de señalización con proteína quinasa C específica del ojo (ePKC) y potencial del receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA). Sin embargo, las propiedades bioquímicas del canal TRP de Drosophila siguen sin estar claras. Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno TRP. Primero, el fragmento NORPA 863-1095 marcado con histidina purificada (His) se unió a cuentas de Ni y se usó como cebo para derribar el complejo endógeno de proteína INAD de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila. Luego, se agregó un fragmento excesivo de glutatión S-transferasa purificada (GST) marcado con TRP 1261-1275 a las cuentas de Ni para competir con el canal TRP. Finalmente, el canal TRP en el sobrenadante se separó del péptido TRP 1261-1275 excesivo mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Este método permite estudiar el mecanismo de cierre del canal TRP de Drosophila desde ángulos bioquímicos y estructurales. Las propiedades electrofisiología de los canales TRP de Drosophila purificados también se pueden medir en el futuro.
Introduction
La fototransducción es un proceso en el que los fotones absorbidos se convierten en códigos eléctricos de las neuronas. Transmite exclusivamente opsinas y la siguiente cascada de señalización acoplada a proteína g tanto en vertebrados como en invertebrados. En Drosophila, mediante el uso de sus cinco dominios PDZ, la inactivación de la proteína de andamio-no-después del potencial D (INAD) organiza un complejo de señalización supramolecular, que consiste en un canal de potencial de receptor transitorio (TRP), potencial de receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA) y proteína quinasa C específica del ojo (ePKC)1. La formación de este complejo de señalización supramolecular garantiza la correcta localización subcelular, alta eficiencia y especificidad de la maquinaria de fototransducción Drosophila. En este complejo, los canales TRP sensibles a la luz actúan como efectores aguas abajo de NORPA y median la afluencia de calcio y la despolarización de los fotorreceptores. Estudios previos mostraron que la apertura del canal TRP de Drosophila está mediada por protones, interrupción del entorno lipídico local o fuerza mecánica 2,3,4. El canal TRP de Drosophila también interactúa con la calmodulina5 y es modulado por el calcio por retroalimentación positiva y negativa 6,7,8.
Hasta ahora, los estudios de electrofisiología sobre el mecanismo de cierre de los canales TRP de Drosophila y TRP-like (TRPL) se basaron en parches de membrana extirpados, registros de células enteras de fotorreceptores disociados de Drosophila de tipo silvestre y canales heteroexpresados en células S2, SF9 o HEK 2,9,10,11,12,13, pero no en canales purificados. La información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa tampoco está clara. Para estudiar las propiedades electrofisiológicas de la proteína purificada en un entorno de membrana reconstituida y obtener información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa, la obtención de canales TRP de longitud completa purificados es el primer paso necesario, similar a las metodologías utilizadas en los estudios de canales de TRP de mamíferos 14,15,16,17.
Recientemente, sobre la base del mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD 18,19,20, se desarrolló por primera vez una estrategia de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal TRP de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila mediante perlas de estreptavidina 5. Teniendo en cuenta la baja capacidad y el costoso costo de las perlas de estreptavidina, aquí se introduce un protocolo de purificación mejorado que utiliza proteína de cebo marcada con His y las correspondientes perlas de Ni de bajo costo con una capacidad mucho mayor. El método propuesto ayudará a estudiar el mecanismo de cierre del canal TRP desde ángulos estructurales y a medir las propiedades electrofisiológicas del canal TRP con proteínas purificadas.
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Protocol
1. Purificación de fragmentos de TRP etiquetados con GST y NORPA con su etiqueta
- Purificar el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST
- Transformar el plásmido pGEX 4T-1 TRP 1261-127510 en células de Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizando el método de transformación de choque térmico CaCl2 21. Inocular una sola colonia en 10 mL de Luria Bertani (LB) mediana y crecer durante la noche a 37 °C. Luego, amplifique los 10 ml de cultivo de siembra en 1 L de LB medio a 37 ° C.
- Después de que la densidad óptica (OD600) de las células alcance 0.5, enfríe las células a 16 ° C y agregue 0.1 mM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG; concentración final) para inducir la sobreexpresión de la proteína objetivo e incube a 16 ° C durante 18 h.
- Después de la sobreexpresión, pellet 1 L de células cultivadas por centrifugación a 3.993 × g durante 20 min y resuspend en 40 mL de tampón salino tamponado con fosfato (PBS).
- Cargue las celdas resuspendidas en un homogeneizador de alta presión preenfriado a 4 °C. Aumente lentamente la presión del homogeneizador a 800 bar. Abra el grifo de entrada y deje que las celdas resuspendidas pasen circularmente a través de una válvula con ranuras muy estrechas.
NOTA: Las células están homogeneizadas por las altas fuerzas de cizallamiento causadas por una gran caída de presión y cavitación. - Cargue 5 ml de perlas de glutatión en una columna de flujo por gravedad y lave las perlas con 50 ml de tampón PBS para un total de tres veces.
- Centrifugar el lisado celular del homogeneizador de alta presión a 48.384 x g. Añadir el sobrenadante del lisado centrifugado de células (40 ml) a las perlas de glutatión equilibradas en la columna de flujo de gravedad e incubar durante 30 min a 4 °C. Resuspend las cuentas de glutatión cada 10 min.
- Después de 30 minutos de incubación, abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo. Descarte la fracción de flujo continuo. Enjuague las perlas de glutatión restantes dos veces con 50 ml de tampón PBS.
- Agregue 15 ml de tampón de elución a las cuentas de glutatión e incube durante 30 min. Resuspendir las cuentas cada 10 min.
- Después de 30 min de incubación, eluya el fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST en un tubo cónico de 50 ml y cargue en una columna de exclusión de tamaño (grado de preparación), que se equilibra utilizando un tampón Tris de 50 mM (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM TDT).
- Mantenga el caudal de elución de la columna de exclusión de tamaño a 3 ml/min. Recoger las proteínas eluidas a razón de 5 ml/tubo.
- Identificar el pico de la proteína diana en la columna de exclusión de tamaño analizando las señales de absorción UV a 280 nm y verificar mediante análisis de gel SDS-PAGE (parámetros de electroforesis: 150 V para el gel de apilamiento; 200 V para el gel de resolución). Mancha el gel con Coomassie azul R250.
- Concentre el fragmento purificado de TRP 1261-1275 marcado con GST de la columna de exclusión de tamaño a 1 ml utilizando una columna de espín de ultrafiltración de 15 ml centrifugada a 3.000 x g a 4 °C en una centrífuga refrigerada de escritorio.
- Determinar la concentración de proteína concentrada utilizando la Ley de Beer-Lambert. Mida la absorción UV del fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST a 280 nm utilizando un espectrofotómetro.
- Obtener el coeficiente de extinción a 280 nm importando las secuencias de proteínas en el programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Típicamente, el cultivo de 1 L de TRP 1261-1275 marcado con GST produce 1 mL de 600 μM de proteína (6 x 10-7 mol). Consulte la Tabla 1 para los materiales necesarios.
- Purificación del fragmento NORPA 863-1095 etiquetado con His
- Transformar el plásmido pETM.3C NORPA 863-109520 en células de E. coli BL21 (DE3) utilizando el método de transformación de choque térmico CaCl2 21. Inocular una sola colonia en 10 mL de LB medio y crecer durante la noche a 37 °C. Luego, amplifique el cultivo de siembra de 10 ml en 1 L de LB medio a 37 ° C.
- Después de que el OD600 de las células alcance 0.5, enfríe las células a 16 ° C y agregue 0.1 mM IPTG (concentración final) para inducir la sobreexpresión de la proteína objetivo e incubar a 16 ° C durante 18 h.
- Después de la sobreexpresión, pellet 1 L de células cultivadas por centrifugación a 3.993 x g durante 20 min y resuspend en 40 mL de tampón de unión. A continuación, lise las células resuspendidas en un homogeneizador de alta presión a 4 °C como se describe en el paso 1.1.4.
- Cargue 5 ml de perlas de Ni en una columna de flujo por gravedad y lave tres veces con 50 ml de tampón de unión.
- Centrifugar el lisado celular del homogeneizador de alta presión a 48.384 x g. Añadir el sobrenadante del lisado centrifugado a las perlas de Ni equilibradas en la columna de flujo de gravedad e incubar durante 30 min a 4 °C. Resuspend las cuentas de Ni cada 10 min.
- Después de 30 minutos de incubación, abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo. Deseche la fracción de flujo continuo y lave las perlas de Ni restantes dos veces con 50 ml de tampón de lavado.
- Agregue 15 ml de tampón de elución a las perlas de Ni e incube durante 30 min. Resuspend las cuentas de Ni cada 10 min.
- Después de 30 min de incubación, recoja el fragmento NORPA 863-1095 eluido con etiqueta His en un tubo cónico de 50 ml y cárguelo en una columna de exclusión de tamaño (grado de preparación), que se equilibra utilizando 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM TDT).
- Mantenga el caudal de elución de la columna de exclusión de tamaño a 3 ml/min. Recoger la proteína eluida a razón de 5 ml/tubo.
- Identificar el pico de la proteína diana en la columna de exclusión de tamaño analizando las señales de absorción UV a 280 nm y verificar mediante análisis de gel SDS-PAGE (parámetros de electroforesis: 150 V para el gel de apilamiento; 200 V para el gel de resolución). Mancha el gel usando Coomassie blue R250.
- Concentre el fragmento norpa 863-1095 purificado de la columna de exclusión de tamaño a 1 ml utilizando una columna de espín de ultrafiltración de 15 ml centrifugada a 3.000 x g a 4 °C en una centrífuga refrigerada de escritorio.
- Determinar la concentración de proteína concentrada utilizando la Ley de Beer-Lambert. Mida la absorción UV del fragmento NORPA 863-1095 marcado con His a 280 nm utilizando un espectrofotómetro.
- Obtener el coeficiente de extinción a 280 nm importando las secuencias de proteínas en el programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Típicamente, 1 L de cultivo de fragmento NORPA 863-1095 marcado con His produce 1 mL de 600 μM de proteína (6 x 10-7 mol). Consulte la Tabla 2 para los materiales necesarios.
2. Preparación de cabezas de Drosophila
- Recolectar moscas adultas en tubos de centrifugación cónica de 50 ml utilizando el método de anestesia de CO2 22,23; congelar inmediatamente en nitrógeno líquido durante 10 min y almacenar en un congelador de -80°C.
- Después de recolectar un número suficiente de moscas, agite vigorosamente los tubos cónicos congelados de 50 ml a mano para separar las patas, cabezas, alas y cuerpos de las moscas. Transfiera la mezcla a tres tamices de acero inoxidable preenfriados apilados secuencialmente (tamaño de malla 20/30/40, respectivamente) y agite los tamices.
- A continuación, dado que las cabezas no pueden pasar a través del tamiz de 40 mallas, use un cepillo para barrer las cabezas de las moscas del tamiz de 40 mallas, transfiéralas a tubos cónicos de 50 ml y guárdelas a -80 ° C.
- Recoger continuamente las moscas y sus cabezas y almacenarlas en un congelador de -80 °C hasta que alcancen la cantidad requerida necesaria para la experimentación (0,5 g). Por lo general, para recolectar 0,5 g de cabezas, se necesitan 35 ml de moscas en un tubo cónico de 50 ml. Consulte la Tabla 3 para los materiales necesarios.
3. Purificación del canal TRP de Drosophila
- Pesar un total de 0,5 g de cabezales y homogeneizar completamente en nitrógeno líquido utilizando un mortero preenfriado. Disolver los cabezales homogeneizados en tampón de lisis 10x v/w (5 mL), incubar en un agitador a 4 °C durante 20 min, y luego centrifugar a 20.817 x g durante 20 min a 4 °C.
- Recoge el sobrenadante spin-down ("20817 g S", Figura 4) y centrífugalo aún más a 100.000 x g durante 60 min a 4 °C. Utilice el sobrenadante spin-down ("100.000 g S", Figura 4) para el siguiente ensayo desplegable.
- Agregue 1 ml de perlas de Ni en la columna de flujo de gravedad y lave las perlas con 10 ml de H2O (ddH 2 O) de doble destilación a 4° C para un total de tres veces. Equilibre las cuentas con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis tres veces a 4 °C.
- Añadir 500 μL de proteína NORPA 863-1095 purificada con 600 μM (3 x 10-7 mol) en la columna de Ni e incubar durante 30 min a 4 °C. Resuspendir las cuentas cada 10 min.
- Abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo. Tome la fracción de flujo continuo para el análisis SDS-PAGE (NORPA F, Figura 4). En esta sección, las proteínas de cebo se inmovilizan en las perlas de Ni.
- Lave las perlas de Ni con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis (10 ml) a 4 °C y mantenga la fracción de lavado para el análisis SDS-PAGE (Lavado 1, Figura 4A). Repita los pasos anteriores y guarde la muestra para el análisis SDS-PAGE (Lavado 2, Figura 4A). En esta sección, se eliminan las proteínas de cebo excesivas en las perlas de Ni.
- Añadir el sobrenadante del homogeneizado de cabeza de Drosophila después de una centrifugación de 100.000 x g en la columna de Ni a 4 °C, donde se ha inmovilizado el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His.
- Incubar el sobrenadante con las perlas de Ni a 4 °C durante 30 min. Resuspendir las cuentas cada 10 min. Luego, abra el grifo de salida de la columna para separar las cuentas y la fracción de flujo.
- Recoger el sobrenadante para el análisis SDS-PAGE (Lisis F de la cabeza de Dro, Figura 4A). En esta sección, los complejos de proteínas INAD (INAD/TRP/ePKC) en los homogeneizados de la cabeza son capturados por los fragmentos inmovilizados de NORPA 863-1095 en las perlas de Ni.
- Lave las perlas de Ni con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis (10 ml) a 4 °C y mantenga el sobrenadante de la precipitación por gravedad para el análisis SDS-PAGE (Lavado 3, Figura 4A). Repita los pasos anteriores y recoja el sobrenadante para el análisis SDS-PAGE (Lavado 4, Figura 4A). En esta sección, se eliminan las proteínas no unidas en las perlas de Ni.
- Añadir 500 μL de 600 μM de proteína TRP 1261-1275 marcada con GST (3 x 10-7 mol) en las perlas de Ni e incubar durante 20 min a 4 °C. Resuspendir las cuentas cada 10 min.
- Recoja la fracción eluida de la columna de gravedad (TRP E1, Figura 4B), que contiene el canal endógeno Drosophila TRP. Repita los pasos anteriores y recoja la fracción de elución (PRT E2, Figura 4B). En este paso, al utilizar los fragmentos TRP 1261-1275 etiquetados con GST como competidor, los canales TRP se eluyen de los complejos de proteínas INAD capturados (INAD / TRP / ePKC) en las cuentas de Ni.
- Lavar las perlas de Ni con 10 volúmenes de columna de tampón de unión (10 ml; Tabla 1) a 4 °C y recoger la fracción de lavado para el análisis SDS-PAGE (Lavado 5, Figura 4B).
- Añadir 500 μL de tampón de elución (Tabla 1) en las perlas de Ni e incubar durante 20 min a 4 °C. Recoger la fracción de elución de la columna de flujo de gravedad (NORPA E1, Figura 4B). Repita los pasos anteriores y recoja la fracción de elución (NORPA E2, Figura 4B).
- Usando el tampón de elución, elute el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His acompañado de los complejos de proteínas INAD/ePKC. A continuación, resuspend las perlas de Ni en 500 μL de tampón de unión.
- Tome las perlas de Ni resuspendidas para ejecutar el SDS-PAGE (teñido por coomassie azul R250) para analizar la eficiencia de la elución y evaluar si el tampón eluye (perlas, Figura 4B). Consulte la Tabla 4 para los materiales necesarios.
4. Purificación de la columna de exclusión de tamaño del canal TRP de Drosophila
- Instale una columna de exclusión de tamaño (grado analítico) en el sistema de purificación de proteínas. Equilibrar la columna con el tampón de columna (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.75 mM DDM), que se filtra mediante un filtro de 0.45 μm.
- Concentre la fracción TRP E1 y E2 del paso 3.14 utilizando una columna de espín de ultrafiltración de 4 ml, centrifugada a 3.000 x g a 4 °C en una centrífuga refrigerada.
- Enjuague el bucle de muestra con el búfer de columna y cargue la muestra en el bucle de muestra. Inyecte la muestra en la columna de exclusión de tamaño y eluya las proteínas con un caudal adecuado (0,5 ml/min).
- Identifique el pico de la proteína objetivo por absorción a 280 nm y ejecute un gel SDS-PAGE para detectar el canal endógeno purificado de Drosophila TRP (Figura 5). Consulte la Tabla 5 para los materiales necesarios.
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Representative Results
En este artículo, se demuestra un método de purificación de proteínas para purificar el canal endógeno de Drosophila TRP (Figura 1).
En primer lugar, se aplica la expresión y purificación de proteínas recombinantes para obtener las proteínas de cebo y de la competencia. Luego, un fragmento de TRP 1261-1275 marcado con GST se expresa en células de E. coli BL21 (DE3) en medio LB y se purifica utilizando perlas de glutatión y una columna de exclusión de tamaño (Figura 2). Las muestras se verificaron mediante el análisis SDS-PAGE con tinción de Coomassie azul R250. En el proceso de preparación de muestras SDS-PAGE, 30 μL de muestra de proteína se mezclan con 10 μL de colorante de carga 4x y se hierven a 100 °C durante 10 min. Luego, 15 μL de muestra hervida se cargan individualmente en cada pozo. El fragmento NORPA 863-1095 marcado con His también se expresa de manera similar en células de E. coli BL21 (DE3) en medio LB y se purifica mediante perlas de Ni y columna de exclusión de tamaño (Figura 3). El TRP 1261-1275 purificado marcado con GST y el NORPA 863-1095 etiquetado con His se concentran para la purificación del canal endógeno Drosophila TRP.
En segundo lugar, las cabezas de Drosophila se recogen y homogeneizan en nitrógeno líquido utilizando un mortero-mortero preenfriado, y luego se disuelven en un tampón de lisis de 10x v / w (Tabla 4). El homogeneizado de cabeza disuelta se incuba en un agitador a 4 °C durante 20 min y se centrifuga a 20.817 x g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante spin-down (20817 g S, Figura 4A) se recoge y se centrifuga a 100.000 x g durante 60 min a 4 °C. El segundo sobrenadante spin-down (100.000 g S, Figura 4A) se utiliza para el ensayo pull-down posterior.
Finalmente, sobre la base de los principios de pull-down y ensayo de competencia, la estrategia de purificación de afinidad más competencia se utiliza para purificar el canal endógeno TRP. El fragmento purificado de NORPA 863-1095 marcado con His se une a las perlas de Ni y se usa como cebo para derribar los complejos endógenos de proteínas INAD de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila . Luego, se agrega un fragmento TRP 1261-1275 purificado excesivo para competir por el canal TRP de los complejos INAD capturados en las cuentas de Ni (TRP E1, TRP E2, Figura 4B). Al final, el canal TRP eluido se separa del péptido TRP 1261-1275 marcado con GST excesivo mediante cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 5). En el proceso de preparación de muestras SDS-PAGE, 30 μL de muestra de proteína se mezclan con 10 μL de colorante de carga 4x y se hierven a 100 °C durante 10 min. Luego, los 15 μL de muestra se cargan individualmente en cada pozo. Como subproducto, los complejos INAD-ePKC-NORPA 863-1095 también se pueden obtener eluyendo las perlas de Ni después de la competencia de péptidos TRP 1261-1275 (NORPA E1, NORAP E2, Figura 4B). Usando este método, el rendimiento típico del canal final purificado de Drosophila TRP de 0,5 g de cabezas de mosca es de 50 μL de proteína TRP de 3 μM (1,5 x 10-10 mol). Si se necesitan más canales TRP purificados, aumente la cantidad de cabezas de mosca, cuentas de Ni, proteína de cebo y competidor correspondientemente.
Figura 1: El diagrama esquemático para la purificación del canal endógeno de Drosophila TRP. (A) Las proteínas NORPA 863-1095 marcadas con His purificadas se inmovilizan en las perlas de Ni. (B) Las cabezas de Drosophila se homogeneizan y el sobrenadante spin-down después de una centrifugación de 100.000 x g se añade a las perlas de Ni unidas a NORPA, donde la proteína NORPA 863-1095 actúa como cebo para capturar los complejos endógenos de proteínas INAD (INAD/TRP/ePKC). (C) El fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST se agrega para competir por el canal endógeno Drosophila TRP de los complejos de proteínas INAD capturados. (D) La proteína TRP eluida se purifica aún más mediante una columna de exclusión de tamaño para separar el fragmento excesivo de TRP 1261-1275 marcado con GST. Las flechas rojas resaltan las posiciones de elución del canal TRP y el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Purificación de la proteína TRP-CT 1261-1275 marcada con GST mediante perlas de glutatión y cromatografía de exclusión de tamaño. (A) Perfil de purificación de la proteína TRP-CT 1261-1275 marcada con GST en una columna de exclusión de tamaño (grado de preparación). Las fracciones se recogen a 5 ml/tubo. Las fracciones en la posición de flecha (tubos 44-48) se recogen y concentran para la siguiente purificación del canal endógeno TRP. (B) Gel SDS-PAGE teñido de azul coomassie R250 que muestra el fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST en la purificación de afinidad de perlas de glutatión y la posterior purificación de la columna de exclusión de tamaño. La flecha resalta la posición del fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST en el gel SDS-PAGE. Abreviaturas: P: pellet de E. coli. Lisado celular BL21 (DE3) después de la homogeneización en tampón PBS y centrifugación a 48.384 x g; S: sobrenadante de E. coli. LISATO CELULAR BL21 (DE3) después de homogeneización y centrifugación a 48.384 x g; F: fracción de flujo continuo después de la fracción S previa incubada con perlas de glutatión durante 30 min a 4 °C; W1 y W2: la primera y segunda fracción de lavado por volúmenes de columna de tampón PBS; B: La proteína no eluida en las perlas de glutatión resuspendidas se analiza mediante el gel SDS-PAGE para evaluar la eficiencia de la elución; E: fracción de elución de perlas de glutatión por tampón de elución. La receta tampón para la purificación de proteínas marcadas con GST se describe en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Purificación de la proteína NORPA 863-1095 marcada con His mediante perlas de Ni y cromatografía de exclusión de tamaño. (A) Perfil de purificación de la proteína NORPA 863-1095 marcada con His en una columna de exclusión de tamaño. Caudal = 3 mL/min. Las fracciones se recogen a 5 ml/tubo. Las fracciones en la posición de flecha (tubos 44-49) se recogen y concentran para la siguiente purificación del canal endógeno TRP. (B) Gel SDS-PAGE teñido de azul coomassie R250 que muestra la proteína NORPA 863-1095 marcada con His en la purificación de la columna de Ni y la posterior purificación de la columna de exclusión de tamaño. La flecha resalta la posición de la proteína NORPA 863-1095 marcada con His en el gel SDS-PAGE. Abreviaturas: P: pellet de E. coli. LISATO DE CÉLULAS BL21 (DE3) después de la homogeneización en tampón de unión y centrifugación a 48.384 x g; S: fracción sobrenadante de E. coli. LISATO CELULAR BL21 (DE3) después de homogeneización y centrifugación a 48.384 x g; F: fracción de flujo continuo después de que la fracción S anterior se incuba con perlas de Ni durante 30 min a 4 °C; W1 y W2: la primera y segunda fracción de lavado por 10 volúmenes de columna de tampón de lavado; B: Proteína no eluida en las perlas de Ni resuspendidas después de la elución; E: fracciones de elución de Ni-perlas por el tampón de elución. La receta tampón para la purificación de proteínas marcadas con His se enumera en la Tabla 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Purificación del canal endógeno Drosophila TRP. Las muestras recogidas de cada paso son analizadas por SDS-PAGE y teñidas con el tinte azul Coomassie R-250. (A) 20817 g S: fracción sobrenadante de la cabeza homogeneizada después de una centrifugación de 20.817 x g ; NORPA F: fracción de flujo continuo de cuentas de Ni después de la unión de fragmentos NORPA 863-1095 marcada por His; Wash1 y Wash2: la primera y segunda fracción de lavado de ni-perlas por tampón de lisis después de la unión NORPA 863-1095 marcada con His; 100.000 g S: el sobrenadante S anterior de 20.817 g se centrifuga aún más a 100.000 x g y el sobrenadante se recoge para SDS-PAGE; Lisis F de la cabeza de Dro: fracción de flujo continuo de cuentas de Ni después de la incubación con la muestra de 100.000 g S; Wash3 y Wash4: lavado de fracciones de Ni-beads por tampón de lisis después de la incubación con muestra de 100.000 g S. (B) TRP E1 y E2: la primera y segunda fracciones de canal TRP eluidas por el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST; Wash5: lavado de fracciones de cuentas de Ni mediante tampón de encuadernación después de la competencia por TRP 1261-1275 etiquetado con GST; NORPA E1 y E2: la primera y segunda fracción de elución de fragmentos NORPA 863-1095 marcados con los complejos INAD/ePKC capturados; perlas: proteína no eluida que permanece en las perlas de Ni resuspendidas después del tratamiento con tampón de elución. La receta tampón para la purificación endógena del canal TRP de Drosophila se describe en la Tabla 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Purificación de la proteína endógena del canal TRP de Drosophila mediante cromatografía de exclusión de tamaño. (A) Perfil de purificación de la proteína endógena del canal TRP de Drosophila en columna de exclusión de tamaño. Caudal = 0,5 mL/min. Las fracciones se recogieron a 0,5 ml/tubo. Las fracciones en la posición de flecha (1E8-1F2) fueron recolectadas y concentradas. (B) Gel SDS-PAGE teñido de azul coomassie R-250 que muestra la proteína endógena del canal TRP de Drosophila después de la purificación de la columna de exclusión de tamaño. La posición de la proteína del canal TRP endógena purificada de Drosophila se resalta con la flecha roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Materiales necesarios para la purificación del fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Materiales necesarios para la purificación del fragmento NORPA 863-1095 etiquetado por His. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Materiales necesarios para la preparación de las cabezas de Drosophila. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4: Materiales necesarios para la purificación del canal TRP de Drosophila. Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
Tabla 5: Materiales necesarios para la purificación de la columna de exclusión de tamaño del canal TRP de Drosophila. Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
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Discussion
INAD, que contiene cinco dominios PDZ, es el organizador central de la maquinaria de fototransducción Drosophila. Estudios previos demostraron que INAD PDZ3 se une a la cola terminal C del canal TRP con una especificidad exquisita (KD = 0,3 μM)18. El tándem INAD PDZ45 interactúa con el fragmento NORPA 863-1095 con una afinidad de unión extremadamente alta (KD = 30 nM). Estos hallazgos proporcionan una base bioquímica sólida para diseñar la estrategia de purificación de afinidad más competencia, que permite que el fragmento NORPA CC-PBM se utilice como cebo de extracción, mientras que la cola terminal TRP C (fragmento 1261-1275) funciona como un reactivo competitivo. Por lo tanto, el primer punto crítico para este método es comprender el mecanismo de ensamblaje del complejo INAD y obtener suficientes fragmentos norpa y TRP. Al mismo tiempo, dado que el canal TRP es la proteína de membrana que debe extraerse de la membrana y estabilizarse en solución, el uso de detergente es el segundo punto crítico de este método. Como detergente popular para estudios estructurales y funcionales de canales TRP24,25, n-Dodecyl-B-D-Maltoside (DDM) se utiliza en este método. Si los resultados de la purificación no son satisfactorios, las cualidades de la proteína de cebo, la proteína de la competencia y el detergente deben verificarse cuidadosamente. Además, la eficiencia de extracción de los canales TRP puede ser rastreada por western blot utilizando el anticuerpo TRP.
En un estudio previo5, se utilizaron costosas perlas de estreptavidina para purificar el canal TRP a partir de extractos de cabeza de mosca, lo que limita la purificación de rutina en el laboratorio. Por lo tanto, el método se mejoró mediante el uso de un fragmento NORPA 863-1095 marcado con His-1095 junto con cuentas de Ni para reducir el costo y aumentar el rendimiento. Actualmente, los rendimientos del canal TRP purificado en el método mejorado son suficientes para llevar a cabo un experimento de tinción negativa con microscopio electrónico de transmisión (TEM), en el que los canales TRP purificados forman tetrámeros (datos no mostrados), lo que indica que el proceso de purificación no interrumpe la formación de tetrámeros de los canales TRP. Por lo tanto, este protocolo será potencialmente adecuado para futuros experimentos de crio-EM y electrofisiología.
Sin embargo, dado que los competidores utilizados en los experimentos (fragmento NORPA 863-1095, fragmento TRP 1261-1275) tienen afinidades de unión similares con las proteínas de tipo salvaje, la limitación de este método es que se deben usar proteínas competitivas masivas y perlas para derribar la proteína objetivo. No será conveniente para los laboratorios que no pueden purificar el cebo a gran escala.
Una posible aplicación futura de este método será estudiar la información estructural del canal TRP de Drosophila utilizando técnicas Cryo-EM. Además, también es factible medir las propiedades electrofisiológicas de los canales endógenos de TRP purificados en la membrana lipídica bicapa artificial. Además, en este sistema modelo reconstituido, será interesante caracterizar las propiedades electrofisiológicas de los canales endógenos purificados de TRP modulando la composición del complejo INAD y la composición lipídica. Finalmente, combinados con la información estructural y las propiedades electrofisiológicas, los mecanismos de cierre y regulación del canal TRP pueden examinarse cuidadosamente en el futuro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (No. 2021A1515010796) a W. L. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) por su asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
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