Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Oprensning af endogene drosophila transiente receptorpotentialekanaler

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63260
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Baseret på samlingsmekanismen for INAD-proteinkomplekset blev der i denne protokol udviklet en modificeret affinitetsrensning plus konkurrencestrategi for at rense den endogene Drosophila TRP-kanal.

Abstract

Drosophila fototransduktion er en af de hurtigste kendte G-proteinkoblede signalveje. For at sikre specificiteten og effektiviteten af denne kaskade binder calciumkanalen (Ca2+)-permeabel kationkanal, transient receptorpotentiale (TRP), tæt til stilladsproteinet, inaktivering-no-after-potential D (INAD) og danner et stort signalproteinkompleks med øjenspecifik proteinkinase C (ePKC) og phospholipase Cβ/No receptorpotentiale A (PLCβ/NORPA). Imidlertid forbliver de biokemiske egenskaber ved Drosophila TRP-kanalen uklare. Baseret på samlingsmekanismen for INAD-proteinkomplekset blev der udviklet en modificeret affinitetsrensning plus konkurrencestrategi for at rense den endogene TRP-kanal. For det første blev det rensede histidin (His) -mærkede NORPA 863-1095-fragment bundet til Ni-perler og brugt som agn til at trække det endogene INAD-proteinkompleks ned fra Drosophila-hovedhomogenater . Derefter blev overdreven renset glutathion S-transferase (GST) -mærket TRP 1261-1275 fragment tilsat til Ni-perlerne for at konkurrere med TRP-kanalen. Endelig blev TRP-kanalen i supernatanten adskilt fra det overdrevne TRP 1261-1275 peptid ved størrelsesekskluderende kromatografi. Denne metode gør det muligt at studere gatingmekanismen for Drosophila TRP-kanalen fra både biokemiske og strukturelle vinkler. De elektrofysiologiske egenskaber af rensede Drosophila TRP-kanaler kan også måles i fremtiden.

Introduction

Fototransduktion er en proces, hvor absorberede fotoner omdannes til elektriske koder for neuroner. Det videresender udelukkende opsiner og den følgende G-proteinkoblede signalkaskade hos både hvirveldyr og hvirvelløse dyr. I Drosophila organiserer stilladsproteininaktivering-no-after-potential D (INAD) ved hjælp af sine fem PDZ-domæner et supramolekylært signalkompleks, som består af en transient receptorpotentiale (TRP) kanal, phospholipase Cβ / No receptor potential A (PLCβ / NORPA) og øjenspecifik proteinkinase C (ePKC)1. Dannelsen af dette supramolekylære signalkompleks garanterer den korrekte subcellulære lokalisering, høj effektivitet og specificitet af Drosophila fototransduktionsmaskiner. I dette kompleks fungerer lysfølsomme TRP-kanaler som nedstrøms effektorer af NORPA og medierer calciumtilstrømning og depolarisering af fotoreceptorer. Tidligere undersøgelser viste, at åbningen af Drosophila TRP-kanalen medieres af protoner, forstyrrelse af det lokale lipidmiljø eller mekanisk kraft 2,3,4. Drosophila TRP-kanalen interagerer også med calmodulin5 og moduleres af calcium ved både positiv og negativ feedback 6,7,8.

Hidtil har elektrofysiologiske undersøgelser af gatingmekanismen for Drosophila TRP og TRP-lignende (TRPL) kanaler været baseret på udskårne membranplastre, helcelleoptagelser fra dissocierede vildtype Drosophila fotoreceptorer og heteroudtrykte kanaler i S2-, SF9- eller HEK-celler 2,9,10,11,12,13, men ikke på rensede kanaler. De strukturelle oplysninger om Drosophila TRP-kanalen i fuld længde forbliver også uklare. For at studere de elektrofysiologiske egenskaber af renset protein i et rekonstitueret membranmiljø og for at få strukturel information om Drosophila TRP-kanalen i fuld længde er opnåelse af rensede TRP-kanaler i fuld længde det nødvendige første skridt, svarende til de metoder, der anvendes i pattedyrs TRP-kanalundersøgelser 14,15,16,17.

For nylig blev der baseret på samlingsmekanismen for INAD-proteinkomplekset18,19,20 først udviklet en affinitetsrensning plus konkurrencestrategi for at rense TRP-kanalen fra Drosophila-hovedhomogenater med streptavidinperler5. I betragtning af den lave kapacitet og dyre omkostninger ved streptavidinperler introduceres en forbedret rensningsprotokol her, der bruger His-mærket agnprotein og tilsvarende billige Ni-perler med meget højere kapacitet. Den foreslåede metode vil bidrage til at studere TRP-kanalens gatingmekanisme fra strukturelle vinkler og måle TRP-kanalens elektrofysiologiske egenskaber med rensede proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rensning af GST-mærkede TRP- og His-taggede NORPA-fragmenter

  1. Rens GST-mærket TRP 1261-1275 fragment
    1. PGEX 4T-1 TRP 1261-1275 plasmid10 omdannes til Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) celler ved hjælp af CaCl2 varmechoktransformationsmetoden21. Inokuler en enkelt koloni i 10 ml Luria Bertani (LB) medium og voks natten over ved 37 ° C. Derefter forstærkes 10 ml såkultur i 1 liter LB-medium ved 37 °C.
    2. Når cellernes optiske densitet (OD600) når 0,5, afkøles cellerne til 16 °C og der tilsættes 0,1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG; slutkoncentration) for at inducere overekspressionen af målproteinet og inkuberes ved 16 °C i 18 timer.
    3. Efter overekspression pellet 1 liter dyrkede celler ved centrifugering ved 3.993 × g i 20 minutter og resuspend i 40 ml phosphatbufferet saltvand (PBS) buffer.
    4. De resuspenderede celler indlægges i en højtrykshomogenisator, der er forkølet ved 4 °C. Øg langsomt homogenisatortrykket til 800 bar. Åbn indløbshanen, og lad de resuspenderede celler cirkulere gennem en ventil med meget smalle slidser.
      BEMÆRK: Cellerne homogeniseres af de høje forskydningskræfter forårsaget af et stort trykfald og kavitation.
    5. Der hældes 5 ml glutathionperler til en tyngdekraftsflowsøjle, og perlerne vaskes med 50 ml PBS-buffer i alt tre gange.
    6. Cellelysatet centrifugeres fra højtrykshomogenisatoren ved 48,384 x g. Supernatanten af centrifugeret cellelysat (40 ml) tilsættes til de ækvilibrerede glutathionperler i tyngdestrømskolonnen og inkuberes i 30 minutter ved 4 °C. Resuspend glutathionperlerne hvert 10. minut.
    7. Efter 30 minutters inkubation skal du åbne søjleudløbshanen for at adskille perlerne og gennemstrømningsfraktionen. Kassér gennemstrømningsfraktionen. De resterende glutathionperler skylles to gange med 50 ml PBS-buffer.
    8. Tilsæt 15 ml elueringsbuffer til glutathionperlerne og inkuberes i 30 min. Resuspend perlerne hvert 10. minut.
    9. Efter 30 minutters inkubation elueres det GST-mærkede TRP 1261-1275-fragment i et 50 ml konisk rør og belastning i en størrelsesekskluderingskolonne (præparationskvalitet), som er ækvilibreret ved hjælp af 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) buffer.
    10. Hold elueringshastigheden for størrelsesekskluderingskolonnen til 3 ml /min. De eluterede proteiner opsamles med en hastighed på 5 ml/rør.
    11. Identificer toppen af målproteinet i størrelsesekskluderingskolonnen ved at analysere UV-absorptionssignalerne ved 280 nm og verificere ved SDS-PAGE-gelanalyse (elektroforeseparametre: 150 V for stablingsgelen; 200 V for den opløsende gel). Plet gelen med Coomassie blå R250.
    12. Koncentrer det rensede GST-mærkede TRP 1261-1275-fragment fra størrelsesekskluderingskolonnen til 1 ml ved hjælp af en 15 ml ultrafiltreringsspinsøjle centrifugeret ved 3.000 x g ved 4 ° C i en skrivebordskølet centrifuge.
    13. Bestem koncentrationen af koncentreret protein ved hjælp af Beer-Lambert-loven. Mål UV-absorptionen af GST-mærket TRP 1261-1275 fragment ved 280 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
    14. Opnå udryddelseskoefficienten ved 280 nm ved at importere proteinsekvenserne til Protparam-programmet (https://web.expasy.org/protparam/). Typisk giver 1 L kultur af GST-mærket TRP 1261-1275 1 ml 600 μM protein (6 x 10-7 mol). Se tabel 1 for nødvendige materialer.
  2. Rensning af hans mærkede NORPA 863-1095 fragment
    1. PETM.3C NORPA 863-1095 plasmid20 omdannes til E. coli BL21 (DE3) celler ved hjælp af CaCl2 varmechoktransformationsmetoden21. Inokulere en enkelt koloni i 10 ml LB-medium og vokse natten over ved 37 ° C. Derefter forstærkes 10 ml såkulturen i 1 liter LB-medium ved 37 °C.
    2. Når od600 af cellerne når 0,5, afkøles cellerne til 16 °C og tilsættes 0,1 mM IPTG (slutkoncentration) for at inducere overekspression af målprotein og inkuberes ved 16 °C i 18 timer.
    3. Efter overekspression pelleteres 1 liter dyrkede celler ved centrifugering ved 3.993 x g i 20 minutter og resuspenderes i 40 ml bindingsbuffer. Herefter lyser de resuspenderede celler i en højtrykshomogenisator ved 4 °C som beskrevet i trin 1.1.4.
    4. Hæld 5 ml Ni-perler i en tyngdekraftsstrømningssøjle og vask tre gange med 50 ml bindingsbuffer.
    5. Cellelysatet centrifugeres fra højtrykshomogenisatoren ved 48,384 x g. Supernatanten af centrifugeret cellelysat tilsættes til de ækvilibrerede Ni-perler i tyngdestrømskolonnen og inkuberes i 30 minutter ved 4 °C. Resuspend Ni-perlerne hvert 10. minut.
    6. Efter 30 minutters inkubation skal du åbne søjleudløbshanen for at adskille perlerne og gennemstrømningsfraktionen. Kassér gennemstrømningsfraktionen, og vask de resterende Ni-perler to gange med 50 ml vaskebuffer.
    7. Tilsæt 15 ml elueringsbuffer til Ni-perlerne og inkuberes i 30 min. Resuspend Ni-perlerne hvert 10. minut.
    8. Efter 30 minutters inkubation opsamles det eluterede His-mærkede NORPA 863-1095-fragment i et 50 ml konisk rør og indlæses i en størrelsesekskluderingskolonne (forberedelseskvalitet), som er ækvilibreret ved hjælp af 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    9. Hold elueringshastigheden for størrelsesekskluderingskolonnen til 3 ml /min. Det eluterede protein opsamles med en hastighed på 5 ml/rør.
    10. Identificer toppen af målproteinet i størrelsesekskluderingskolonnen ved at analysere UV-absorptionssignalerne ved 280 nm og verificere ved SDS-PAGE-gelanalyse (elektroforeseparametre: 150 V for stablingsgelen; 200 V for den opløsende gel). Farj gelen med Coomassie blå R250.
    11. Koncentrer det rensede His-mærkede NORPA 863-1095-fragment fra størrelsesekskluderingskolonnen til 1 ml ved hjælp af en 15 ml ultrafiltreringsspinsøjle centrifugeret ved 3.000 x g ved 4 ° C i en bordkølet centrifuge.
    12. Bestem koncentrationen af koncentreret protein ved hjælp af Beer-Lambert-loven. Mål UV-absorptionen af His-tagged NORPA 863-1095 fragment ved 280 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
    13. Opnå udryddelseskoefficienten ved 280 nm ved at importere proteinsekvenserne til Protparam-programmet (https://web.expasy.org/protparam/). Typisk giver 1 L kultur af His-tagged NORPA 863-1095 fragment 1 ml 600 μM protein (6 x 10-7 mol). Se tabel 2 for nødvendige materialer.

2. Forberedelse af Drosophila hoveder

  1. Voksne fluer opsamles i 50 ml koniske centrifugeringsrør ved hjælp af CO2 -bedøvelsesmetoden22,23. Fastfrys straks i flydende nitrogen i 10 minutter og opbevares i en fryser på -80 °C.
  2. Efter at have samlet et tilstrækkeligt antal fluer, ryst kraftigt de frosne 50 ml koniske rør i hånden for at adskille fluernes ben, hoveder, vinger og kroppe. Blandingen overføres til tre sekventielt stablede forkølede sigter af rustfrit stål (henholdsvis 20/30/40 maskestørrelse), og ryst sigterne.
  3. Da hovederne ikke kan passere gennem 40-maskesigten, skal du derefter bruge en børste til at feje fluehovederne af 40-maskesigten, overføre dem til 50 ml koniske rør og opbevare dem ved -80 ° C.
  4. Saml løbende fluerne og deres hoveder og opbevar dem i en -80 ° C fryser, indtil de når den nødvendige mængde til forsøg (0,5 g). For at samle 0,5 g hoveder er der typisk brug for 35 ml fluer i et 50 ml konisk rør. Se tabel 3 for nødvendige materialer.

3. Drosophila TRP-kanalrensning

  1. Væg i alt 0,5 g hoveder og homogeniser fuldstændigt i flydende nitrogen ved hjælp af en forkølet mørtel-pistil. De homogeniserede hoveder opløses i 10x v/w lysisbuffer (5 ml), inkuberes i en ryster ved 4 °C i 20 minutter, og centrifugeres derefter ved 20,817 x g i 20 minutter ved 4 °C.
  2. Spin-down supernatanten opsamles ("20817 g S", figur 4), og centrifuger den yderligere ved 100.000 x g i 60 minutter ved 4 °C. Brug spin-down supernatanten ("100.000 g S", figur 4) til følgende pull-down assay.
  3. Der tilsættes 1 ml Ni-perler i tyngdestrømskolonnen, og perlerne vaskes med 10 ml dobbeltdestilleret H2O (ddH2O) ved 4 °C i alt tre gange. Kuglerne afbalanceres med 10 kolonnevolumener lysisbuffer tre gange ved 4 °C.
  4. Der tilsættes 500 μL 600 μM renset His-tagged NORPA 863-1095 protein (3 x 10-7 mol) i Ni-søjlen og inkuberes i 30 min ved 4 °C. Resuspend perlerne hvert 10. minut.
  5. Åbn søjleudløbshanen for at adskille perlerne og gennemstrømningsfraktionen. Tag gennemstrømningsfraktionen til SDS-PAGE-analyse (NORPA F, figur 4). I dette afsnit immobiliseres agnproteinerne på Ni-perlerne.
  6. Ni-perlerne vaskes med 10 spaltevolumener lysisbuffer (10 ml) ved 4 °C, og vaskefraktionen opbevares til SDS-PAGE-analyse (vask 1, figur 4A). Gentag ovenstående trin, og behold prøven til SDS-PAGE-analyse (vask 2, figur 4A). I dette afsnit fjernes de overdrevne agnproteiner på Ni-perlerne.
  7. Supernatanten af Drosophila-hovedhomogenat efter 100.000 x g centrifugering tilsættes i Ni-søjlen ved 4 °C, hvor det his-mærkede NORPA 863-1095-fragment er blevet immobiliseret.
  8. Inkuber supernatanten med Ni-perlerne ved 4 °C i 30 min. Resuspend perlerne hvert 10. minut. Åbn derefter søjleudløbshanen for at adskille perlerne og gennemstrømningsfraktionen.
  9. Saml supernatanten til SDS-PAGE-analyse (Dro-hovedlysis F, figur 4A). I dette afsnit fanges INAD-proteinkomplekserne (INAD/TRP/ePKC) i hovedhomogenaterne af de immobiliserede NORPA 863-1095-fragmenter på Ni-perlerne.
  10. Ni-perlerne vaskes med 10 kolonnevolumener lysisbuffer (10 ml) ved 4 °C, og supernatanten holdes fra tyngdekraftsudfældning til SDS-PAGE-analyse (vask 3, figur 4A). Gentag ovenstående trin, og saml supernatanten til SDS-PAGE-analyse (vask 4, figur 4A). I dette afsnit fjernes de ubundne proteiner på Ni-perlerne.
  11. Der tilsættes 500 μL 600 μM GST-mærket TRP 1261-1275 protein (3 x 10-7 mol) i Ni-perlerne og inkuberes i 20 minutter ved 4 °C. Resuspend perlerne hvert 10. minut.
  12. Saml den eluterede fraktion fra tyngdekraftskolonnen (TRP E1, figur 4B), som indeholder den endogene Drosophila TRP-kanal. Gentag ovenstående trin, og saml elueringsfraktionen (TRP E2, figur 4B). I dette trin, ved at bruge de GST-mærkede TRP 1261-1275-fragmenter som konkurrent, elueres TRP-kanalerne fra de fangede INAD-proteinkomplekser (INAD / TRP / ePKC) på Ni-perlerne.
  13. Ni-perlerne vaskes med 10 kolonnevolumener bindingsbuffer (10 ml; Tabel 1) ved 4 °C, og vaskfraktionen opsamles til SDS-PAGE-analyse (vask 5, figur 4B).
  14. Der tilsættes 500 μL elueringsbuffer (tabel 1) i Ni-perlerne, og der inkuberes i 20 minutter ved 4 °C. Elueringsfraktionen opsamles fra tyngdekraftsflowkolonnen (NORPA E1, figur 4B). Gentag ovenstående trin, og saml elueringsfraktionen (NORPA E2, figur 4B).
  15. Ved hjælp af elueringsbufferen elueres det His-mærkede NORPA 863-1095-fragment ledsaget af INAD/ePKC-proteinkomplekserne. Derefter resuspender Ni-perlerne i 500 μL bindingsbuffer.
  16. Tag de resuspenderede Ni-perler til at køre SDS-PAGE (farvet af Coomassie blå R250) for at analysere effektiviteten af elutionen og evaluere, om den elute buffer fungerer (perler, figur 4B). Se tabel 4 for nødvendige materialer.

4. Oprensning af størrelsesekskluderende søjlerensning af Drosophila TRP-kanal

  1. Installer en størrelsesekskluderingskolonne (analytisk kvalitet) på proteinrensningssystemet. Ligevægt søjlen med søjlebufferen (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), som filtreres af et 0,45 μm filter.
  2. TRP E1- og E2-fraktionen koncentreres fra trin 3.14 ved hjælp af en 4 ml ultrafiltreringsspinsøjle, centrifugeret ved 3.000 x g ved 4 °C i en kølecentrifuge.
  3. Prøvesløjfen skylles med søjlebufferen, og prøven lægges i prøvesløjfen. Prøven injiceres i størrelsesekskluderingskolonnen, og proteinerne elueres med en korrekt strømningshastighed (0,5 ml/min).
  4. Identificer toppen af målproteinet ved absorption ved 280 nm og kør en SDS-PAGE gel for at detektere den rensede endogene Drosophila TRP-kanal (figur 5). Se tabel 5 for nødvendige materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne artikel demonstreres en proteinrensningsmetode til rensning af endogen Drosophila TRP-kanal (figur 1).

For det første anvendes rekombinant proteinekspression og oprensning for at opnå agn og konkurrerende proteiner. Derefter udtrykkes et GST-mærket TRP 1261-1275-fragment i E. coli BL21 (DE3) celler i LB-medium og renses ved hjælp af glutathionperler og en størrelsesekskluderingskolonne (figur 2). Prøverne blev verificeret ved hjælp af SDS-PAGE analyse med Coomassie blå R250 farvning. I SDS-PAGE-prøveforberedelsesprocessen blandes 30 μL proteinprøve med 10 μL 4x påfyldningsfarvestof og koges ved 100 ° C i 10 minutter. Derefter lægges 15 μL kogt prøve individuelt i hver brønd. Det his-mærkede NORPA 863-1095-fragment udtrykkes også på samme måde i E. coli BL21 (DE3) celler i LB-medium og renset af Ni-perler og størrelsesekskluderingskolonne (figur 3). Den rensede GST-mærkede TRP 1261-1275 og His-tagged NORPA 863-1095 er koncentreret til rensning af den endogene Drosophila TRP-kanal.

For det andet opsamles og homogeniseres Drosophila-hoveder i flydende nitrogen ved hjælp af en forkølet mørtel-pistil og opløses derefter i 10x v / w lysisbuffer (tabel 4). Homogenatet af opløst hoved inkuberes i en ryster ved 4 °C i 20 minutter og centrifugeres ved 20,817 x g i 20 minutter ved 4 °C. Spin-down supernatanten (20817 g S, figur 4A) opsamles og centrifugeres yderligere ved 100.000 x g i 60 minutter ved 4 °C. Den anden spin-down supernatant (100.000 g S, figur 4A) bruges til den efterfølgende pull-down assay.

Endelig, baseret på principperne om pull-down og konkurrenceanalyse, bruges affinitetsrensning plus konkurrencestrategi til at rense den endogene TRP-kanal. Det rensede His-mærkede NORPA 863-1095-fragment er bundet til Ni-perler og bruges som lokkemad til at trække de endogene INAD-proteinkomplekser ned fra Drosophila-hovedhomogenater . Derefter tilføjes overdreven renset GST-mærket TRP 1261-1275-fragment for at konkurrere om TRP-kanalen fra de fangede INAD-komplekser på Ni-perlerne (TRP E1, TRP E2, figur 4B). I sidste ende adskilles den eluterede TRP-kanal fra det overdrevne GST-mærkede TRP 1261-1275-peptid ved størrelsesekskluderende kromatografi (figur 5). I SDS-PAGE-prøveforberedelsesprocessen blandes 30 μL proteinprøve med 10 μL 4x påfyldningsfarvestof og koges ved 100 ° C i 10 minutter. Derefter lægges de 15 μL prøve individuelt i hver brønd. Som biprodukt kan INAD-ePKC-NORPA 863-1095-komplekserne også opnås ved at eluere Ni-perlerne efter TRP 1261-1275 peptidkonkurrence (NORPA E1, NORAP E2, figur 4B). Ved anvendelse af denne metode er det typiske udbytte af den endelige rensede Drosophila TRP-kanal fra 0,5 g fluehoveder 50 μL 3 μM TRP-protein (1,5 x 10-10 mol). Hvis der er behov for mere rensede TRP-kanaler, skal du opskalere mængden af fluehoveder, Ni-perler, agnprotein og konkurrent tilsvarende.

Figure 1
Figur 1: Det skematiske diagram til oprensning af endogene Drosophila TRP-kanaler. (A) Rensede His-taggede NORPA 863-1095 proteiner immobiliseres på Ni-perlerne. (B) Drosophila-hoveder homogeniseres, og spin-down-supernatanten efter 100.000 x g centrifugering tilsættes til de NORPA-bundne Ni-perler, hvor NORPA 863-1095-proteinet fungerer som lokkemad til at fange de endogene INAD-proteinkomplekser (INAD / TRP / ePKC). (C) Det GST-mærkede TRP 1261-1275-fragment tilsættes for at konkurrere om den endogene Drosophila TRP-kanal fra de fangede INAD-proteinkomplekser. (D) Det eluterede TRP-protein oprenses yderligere af en størrelsesekskluderingskolonne for at adskille det overdrevne GST-mærkede TRP 1261-1275-fragment. De røde pile fremhæver elueringspositionerne for henholdsvis TRP-kanalen og GST-mærket TRP 1261-1275-fragment. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Oprensning af GST-mærket TRP-CT 1261-1275-protein ved glutathionperler og størrelsesekskluderende kromatografi. (A) Oprensningsprofil for GST-mærket TRP-CT 1261-1275-protein i en størrelsesekskluderingskolonne (præparatkvalitet). Fraktionerne opsamles ved 5 ml/rør. Fraktionerne i pilpositionen (rør 44-48) opsamles og koncentreres til følgende rensning af den endogene TRP-kanal. (B) Coomassie blå R250 farvet SDS-PAGE gel, der viser det GST-mærkede TRP 1261-1275 fragment i Glutathion-perlernes affinitetsrensning og efterfølgende dimensionsudelukkelseskolonnerensning. Pilen fremhæver placeringen af det GST-mærkede TRP 1261-1275-fragment i SDS-PAGE-gelen. Forkortelser: P: pellet fra E. coli. BL21 (DE3) cellelysat efter homogenisering i PBS-buffer og centrifugering ved 48,384 x g; S: supernatant fra E. coli. BL21 (DE3) cellelysat efter homogenisering og centrifugering ved 48,384 x g; F: gennemstrømningsfraktion efter tidligere S-fraktion inkuberet med glutathionperler i 30 minutter ved 4 °C W1 og W2: den første og anden vaskefraktion med 10 kolonnevolumener af PBS-buffer B: U-elueret protein på de resuspenderede glutathionperler analyseres af SDS-PAGE gel for at evaluere elueringseffektiviteten; E: elueringsfraktion fra glutathionperler med elueringsbuffer. Bufferopskriften på den GST-mærkede proteinrensning er beskrevet i tabel 1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Oprensning af his-tagged NORPA 863-1095 protein ved Hjælp af Ni-perler og størrelsesekskluderende kromatografi. (A) Oprensningsprofil af His-tagged NORPA 863-1095 protein i en størrelsesekskluderingskolonne. Strømningshastighed = 3 ml / min. Fraktionerne opsamles ved 5 ml/rør. Fraktionerne i pilpositionen (rør 44-49) opsamles og koncentreres til efterfølgende rensning af den endogene TRP-kanal. (B) Coomassie blå R250 farvet SDS-PAGE gel, der viser det His-mærkede NORPA 863-1095 protein i Ni-kolonnerensning og efterfølgende oprensning af størrelsesekskluderende søjle. Pilen fremhæver placeringen af His-tagged NORPA 863-1095 protein i SDS-PAGE gelen. Forkortelser: P: pellet fra E. coli. BL21 (DE3) cellelysat efter homogenisering i bindingsbuffer og centrifugering ved 48,384 x g; S: supernatantfraktion fra E. coli. BL21 (DE3) cellelysat efter homogenisering og centrifugering ved 48,384 x g; F: gennemstrømningsfraktion efter den forrige S-fraktion inkuberes med Ni-perler i 30 minutter ved 4 °C W1 og W2: den første og anden vaskefraktion med 10 kolonnevolumener af vaskebuffer; B: U-elueret protein på de resuspenderede Ni-perler efter eluering; E: elueringsfraktioner fra Ni-perler ved elueringsbufferen. Bufferopskriften på den his-mærkede proteinrensning er anført i tabel 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Rensning af endogen Drosophila TRP-kanal. De indsamlede prøver fra hvert trin analyseres af SDS-PAGE og farves med Coomassie blå R-250 farvestof. A) 20817 g S: supernatantfraktion af hovedhomogenater efter 20,817 x g centrifugering NORPA F: gennemstrømningsfraktion af Ni-perler efter his-tagged NORPA 863-1095 fragmentbinding; Wash1 og Wash2: den første og anden vaskefraktion af Ni-perler med lysisbuffer efter His-tagged NORPA 863-1095 binding; 100.000 g S: den foregående 20.817 g S supernatant centrifugeres yderligere ved 100.000 x g , og supernatanten opsamles til SDS-PAGE; Dro-hovedlysis F: gennemstrømningsfraktion af Ni-perler efter inkubation med 100.000 g S-prøven; Wash3 og Wash4: vask fraktioner af Ni-perler med lysisbuffer efter inkubation med 100.000 g S prøve. B) TRP E1 og E2: de første og anden eluterede TRP-kanalfraktioner af GST-mærket TRP 1261-1275-fragment Wash5: vask fraktioner af Ni-perler ved bindingsbuffer efter konkurrence af GST-mærket TRP 1261-1275; NORPA E1 og E2: den første og anden elueringsfraktion af His-mærkede NORPA 863-1095-fragmenter med indfangede INAD/ePKC-komplekser; perler: u-elueret protein, der forbliver i de resuspenderede Ni-perler efter elueringsbufferbehandling. Bufferopskriften på endogen Drosophila TRP-kanalrensning er beskrevet i tabel 4. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Oprensning af endogent Drosophila TRP-kanalprotein ved størrelsesekskluderende kromatografi. (A) Oprensningsprofil for endogent Drosophila TRP-kanalprotein i kolonne med størrelsesekskludering. Strømningshastighed = 0,5 ml / min. Fraktionerne blev opsamlet ved 0,5 ml/rør. Fraktionerne i pilpositionen (1E8-1F2) blev opsamlet og koncentreret. (B) Coomassie blå R-250 farvet SDS-PAGE gel, der viser det endogene Drosophila TRP kanalprotein efter oprensning af størrelsesekskluderende søjle. Placeringen af renset endogent Drosophila TRP-kanalprotein fremhæves af den røde pil. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Materialer, der er nødvendige til rensning af det GST-mærkede TRP 1261-1275-fragment. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Materialer, der er nødvendige til rensning af det his-mærkede NORPA 863-1095-fragment. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Materialer, der er nødvendige til fremstilling af Drosophila-hoveder.

Tabel 4: Materialer, der er nødvendige til rensning af Drosophila TRP-kanalen.

Tabel 5: Materialer, der er nødvendige til rensning af størrelsesekskluderende kolonnerensning af Drosophila TRP-kanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

INAD, som indeholder fem PDZ-domæner, er kernearrangøren af Drosophila fototransduktionsmaskiner. Tidligere undersøgelser viste, at INAD PDZ3 binder til TRP-kanalens C-terminale hale med udsøgt specificitet (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interagerer med NORPA 863-1095 fragment med en ekstremt høj bindingsaffinitet (KD = 30 nM). Disse resultater giver et solidt biokemisk grundlag for at designe affinitetsrensning plus konkurrencestrategi, som gør det muligt at anvende NORPA CC-PBM-fragmentet som pulldown-agn, mens TRP C-terminalhalen (fragment 1261-1275) fungerer som et konkurrencedygtigt reagens. Derfor er det første kritiske punkt for denne metode at forstå INAD-kompleksets samlemekanisme og opnå nok NORPA- og TRP-fragmenter. På samme tid, da TRP-kanalen er membranproteinet, der skal ekstraheres fra membranen og stabiliseres i opløsning, er brugen af vaskemiddel det andet kritiske punkt i denne metode. Som et populært vaskemiddel til strukturelle og funktionelle undersøgelser af TRP-kanaler 24,25 anvendes n-Dodecyl-B-D-Maltosid (DDM) i denne metode. Hvis rensningsresultaterne er utilfredsstillende, skal agnproteinets kvaliteter, konkurrentproteinet og vaskemidlet kontrolleres omhyggeligt. Derudover kan ekstraktionseffektiviteten af TRP-kanalerne spores af western blot ved anvendelse af TRP-antistoffet.

I en tidligere undersøgelse5 blev dyre streptavidinperler brugt til at rense TRP-kanalen fra fluehovedekstrakter, hvilket begrænser rutinemæssig rensning i laboratoriet. Derfor blev metoden forbedret ved at bruge et His-mærket NORPA 863-1095 fragment kombineret med Ni-perler for at reducere omkostningerne og øge udbyttet. I øjeblikket er udbyttet af den rensede TRP-kanal i den forbedrede metode tilstrækkeligt til at udføre et transmissionselektronmikroskop (TEM) negativt farvningseksperiment, hvor de rensede TRP-kanaler danner tetramerer (data ikke vist), hvilket indikerer, at rensningsprocessen ikke forstyrrer tetramerdannelsen af TRP-kanaler. Derfor vil denne protokol være potentielt egnet til fremtidige cryo-EM og elektrofysiologiske eksperimenter.

Men da konkurrenterne, der blev brugt i forsøgene (NORPA 863-1095 fragment, TRP 1261-1275 fragment) har lignende bindingsaffiniteter med vildtypeproteiner, er begrænsningen af denne metode, at massive konkurrencedygtige proteiner og perler skal bruges til at trække målproteinet ned. Det vil ikke være praktisk for laboratorier, der ikke kan rense agn i stor skala.

En potentiel fremtidig anvendelse af denne metode vil være at studere de strukturelle oplysninger i Drosophila TRP-kanalen ved hjælp af Cryo-EM-teknikker. Derudover er det også muligt at måle de elektrofysiologiske egenskaber af rensede endogene TRP-kanaler i den kunstige dobbeltlags lipidmembran. Desuden vil det i dette rekonstituerede modelsystem være interessant at karakterisere de elektrofysiologiske egenskaber ved rensede endogene TRP-kanaler ved at modulere INAD-komplekssammensætningen og lipidsammensætningen. Endelig kombineret med strukturelle oplysninger og elektrofysiologiske egenskaber kan TRP-kanalens gating- og reguleringsmekanismer undersøges omhyggeligt i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) og Natural Science Foundation of Guangdong Province, Kina (nr. 2021A1515010796) til W. L. Vi takker LetPub (www.letpub.com) for dets sproglige bistand under udarbejdelsen af dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Tags

Biokemi udgave 178 proteinrensning Drosophila TRP-kanal INAD
Oprensning af endogene <em>drosophila</em> transiente receptorpotentialekanaler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding,… More

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter