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Neuroscience

पार्किंसंस रोग माउस मॉडल एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर एन्कोडिंग मानव α-Synuclein एन्कोडिंग द्वारा प्रेरित का विश्लेषण

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/63313
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2,3,4, 1,5
1Laboratorio de Neuroinmunología, Fundación Ciencia & Vida, 2Center for Integrative Biology, Universidad Mayor, 3FONDAP Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, 4Buck Institute for Research on Ageing, 5Facultad de Medicina y Ciencia, Universidad San Sebastián

Summary

यह काम पार्किंसंस रोग के इस प्रीक्लिनिकल मॉडल में न्यूरोइंफ्लेमेशन, न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि को प्रेरित करने के लिए आवश्यक वेक्टर खुराक और एक्सपोजर समय का विश्लेषण करता है। मानव α-synuclein एन्कोडिंग इन वैक्टरों को पार्किंसंस रोग से जुड़े synuclein विकृति recapitulate करने के लिए substantia nigra में वितरित कर रहे हैं।

Abstract

पार्किंसंस रोग एक न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जिसमें निग्रोस्ट्रियाटल मार्ग के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की मृत्यु शामिल है और परिणामस्वरूप, स्वैच्छिक आंदोलनों के नियंत्रण का प्रगतिशील नुकसान। यह न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रिया मस्तिष्क में प्रोटीन समुच्चय के जमाव से शुरू होती है, जो मुख्य रूप से α-सिन्यूक्लिन का गठन करती है। कई अध्ययनों ने संकेत दिया है कि पार्किंसंस रोग से जुड़े न्यूरोडीजेनेरेशन को विकसित करने के लिए न्यूरोइंफ्लेमेशन की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, neuroinflammatory प्रक्रिया में microglial सक्रियण के साथ-साथ परिधीय टी कोशिकाओं की घुसपैठ शामिल है substantia nigra (एसएन)। यह काम पार्किंसंस रोग के एक माउस मॉडल का विश्लेषण करता है जो माइक्रोग्लियल सक्रियण, एसएन में टी-सेल घुसपैठ, निग्राल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि को दोहराता है। पार्किंसंस रोग का यह माउस मॉडल एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर के स्टीरियोटैक्सिक वितरण से प्रेरित होता है जो एसएन में मानव जंगली-प्रकार के α-सिन्यूक्लिन (एएवी-hαSyn) को एन्कोडिंग करता है। एसएन में वायरल वैक्टर के सही वितरण की पुष्टि नियंत्रण वैक्टर एन्कोडिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) का उपयोग करके की गई थी। इसके बाद, एसएन में प्रशासित एएवी-hαSyn की खुराक ने hαSyn अभिव्यक्ति की सीमा को कैसे प्रभावित किया, निग्राल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के नुकसान और मोटर हानि का मूल्यांकन किया गया। इसके अलावा, hαSyn अभिव्यक्ति, microglial सक्रियण, और टी सेल घुसपैठ की गतिशीलता रोग के विकास के समय के दौरान निर्धारित किया गया था। इस प्रकार, यह अध्ययन महत्वपूर्ण समय बिंदु प्रदान करता है जो पार्किंसंस रोग के इस प्रीक्लिनिकल मॉडल में सिन्यूक्लिन पैथोलॉजी और न्यूरोइंफ्लेमेशन को लक्षित करने के लिए उपयोगी हो सकता है।

Introduction

अल्जाइमर रोग के बाद, पार्किंसंस रोग दुनिया भर में दूसरा सबसे प्रचलित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग है। पार्किंसंस रोग में प्रभावित प्राथमिक न्यूरॉन्स निग्रोस्ट्रिएटल मार्ग के हैं, जो डोपामाइन का उत्पादन करते हैं और स्वैच्छिक आंदोलन को नियंत्रित करते हैं। नतीजतन, इस विकार से जुड़ा सबसे विशिष्ट लक्षण मोटर हानि है। इस विकृति में मस्तिष्क में प्रोटीन समुच्चय का जमाव भी शामिल है, जो मुख्य रूप से α-सिन्यूक्लिन (αSyn)1 से बना है, जो प्रीसिनेप्टिक टर्मिनलों से जुड़ा एक साइटोसोलिक प्रोटीन है। साक्ष्य से पता चला है कि αSyn के रोगजनक समावेशन की पीढ़ी misfolding या इस प्रोटीन2 के कुछ पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों द्वारा ट्रिगर किया जाता है।

विशेष रूप से, αSyn पैथोलॉजी और मानव पार्किंसंस रोग और पशु मॉडल 3,4 में nigrostriatal मार्ग के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के नुकसान के बीच एक घनिष्ठ संबंध स्थापित किया गया है। यह समझना कि αSyn समुच्चय कैसे उत्पन्न होते हैं और वे न्यूरोनल मृत्यु को कैसे प्रेरित करते हैं, क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। अध्ययनों के एक बढ़ते समूह से पता चला है कि, ऑक्सीडेटिव तनाव को बढ़ाकर, माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता αSyn समुच्चय2 की पीढ़ी के लिए प्रमुख कारणों में से एक है। दरअसल, पार्किंसंस रोग के जोखिम से जुड़े कई जीन माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन, आकृति विज्ञान और गतिशीलता 5,6 में शामिल प्रोटीन को एन्कोड करते हैं। इसके अलावा, लाइसोसोमल डिसफंक्शन, जिसके परिणामस्वरूप बेकार माइटोकॉन्ड्रिया और मिसफोल्डेड αSyn का संचय होता है, एक और प्रमुख घटना का गठन करता है जो αSyn समुच्चय7 की पीढ़ी को बढ़ावा देता है।

उभरते हुए सबूतों ने संकेत दिया है कि, एक बार मस्तिष्क में αSyn समुच्चय जमा होने के बाद, ये रोगजनक प्रोटीन माइक्रोग्लिया पर टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) को उत्तेजित करते हैं, इस प्रकार माइक्रोग्लियाल सक्रियण और सबस्टेंसिया निग्रा (एसएन) 8,9 में एक प्रारंभिक भड़काऊ वातावरण को ट्रिगर करते हैं। इसके अलावा, सबूत इंगित करता है कि αSyn समुच्चय पर कब्जा कर लिया जाता है और एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं द्वारा टी कोशिकाओं को प्रस्तुत किया जाता है, जो αSyn10,11 के लिए विशिष्ट अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है। ये αSyn-विशिष्ट टी कोशिकाएं बाद में मस्तिष्क में घुसपैठ करती हैं और सक्रिय माइक्रोग्लिया द्वारा पुन: निर्धारित की जाती हैं, इस प्रकार न्यूरोटॉक्सिक कारकों के स्राव को बढ़ावा देती हैं जो न्यूरोनल मृत्यु को जन्म देतीहैं 9,10। दिलचस्प बात यह है कि सबूतों की कई लाइनों ने सुझाव दिया है कि αSyn समुच्चय पहले आंत्र तंत्रिका तंत्र में उत्पन्न होते हैं और फिर वेगस तंत्रिका के माध्यम से मस्तिष्क स्टेम12 में ले जाया जाता है।

पार्किंसंस रोग के कई पशु मॉडल का उपयोग कई वर्षों से किया गया है, जिसमें न्यूरोटॉक्सिक पदार्थों के प्रशासन से प्रेरित लोग शामिल हैं (यानी, 6-hydroxydopamine, paraquat, rotenone, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) और आनुवंशिक स्थितियों (यानी, उत्परिवर्ती α-synuclein, उत्परिवर्ती ल्यूसीन-समृद्ध दोहराने वाले किनेज 2) के प्रशासन से प्रेरित हैं। . पार्किंसंस रोग के कुछ पहलुओं की नकल करने वाले न्यूरोटॉक्सिन-प्रेरित न्यूरोडीजेनेरेशन से जुड़े मॉडल के बावजूद, उनमें से कोई भी बीमारी के सभी आवश्यक पहलुओं को दोहराता है या प्रगतिशील नहीं है। दूसरी ओर, हालांकि आनुवांशिक माउस मॉडल में ल्यूसीन-समृद्ध दोहराने वाले किनेज 2 के उत्परिवर्ती संस्करणों की अभिव्यक्ति, α-सिन्यूक्लिन के उत्परिवर्ती संस्करण, या मानव जंगली-प्रकार के α-सिन्यूक्लिन के ओवरएक्सप्रेशन के परिणामस्वरूप मोटर हानि होती है और, कुछ मामलों में, सिन्यूक्लिनोपैथी का विकास भी होता है, वे निग्रॉल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के प्रमुख न्यूरोडीजेनेरेशन को पुन: पेश नहीं करते हैं, जो पार्किंसंस रोग13 का एक अनिवार्य पहलू है, १४ । न्यूरोडीजेनेरेशन के एक तीसरे प्रकार के पशु मॉडल ने पार्किंसंस रोग के अधिकांश आवश्यक पहलुओं को पूरा करने में कामयाबी हासिल की है, एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर (एएवी) के स्टीरियोटैक्सिक वितरण ने मानव α-सिन्यूक्लिन (एएवी-hαSyn) को एन्कोडिंग किया है। महत्वपूर्ण रूप से, एएवी उच्च प्रभावकारिता के साथ न्यूरॉन्स के ट्रांसडक्शन की अनुमति देते हैं और स्तनधारियों के वयस्क मस्तिष्क में लंबी अवधि में। इसके अलावा, एसएन में AAV-hαSyn के स्टीरियोटैक्सिक वितरण को रोग के कई आवश्यक पहलुओं को पुन: पेश करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें αSyn पैथोलॉजी, माइक्रोग्लियल सक्रियण, न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि 16,17,18,19,20 शामिल हैं। यह अध्ययन इस बात का विश्लेषण प्रस्तुत करता है कि वायरल वेक्टर की खुराक और वायरल वेक्टर डिलीवरी के बाद का समय nigrostriatal मार्ग में hαSyn अभिव्यक्ति, न्यूरोडीजेनेरेशन और न्यूरोइन्फ्लेमेशन की सीमा को कैसे प्रभावित करता है, साथ ही साथ एसएन में hαSyn के एकतरफा स्टीरियोटैक्सिक वितरण के माउस मॉडल में मोटर हानि की डिग्री।

Protocol

सभी अध्ययन प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के 8 वें संस्करण के तहत किए गए थे। प्रायोगिक प्रोटोकॉल को आईएसीयूसी द्वारा Fundación Ciencia & Vida (साइंस फॉर लाइफ फाउंडेशन) में अनुमोदित किया गया था, जिसमें संज्ञाहरण, दर्द, संकट और इच्छामृत्यु (परमिट संख्या पी -035/2022) शामिल थे।

1. स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी

  1. सर्जरी के लिए तैयारी (लगभग 1 घंटे)
    1. एक एसेप्टिक वातावरण को बनाए रखने के लिए, पूरी सर्जरी के दौरान उचित सर्जिकल कपड़े पहनें, जिसमें जूता कवर, एक सर्जिकल मास्क, एक सैनिटरी बाधा, दस्ताने और एक सर्जिकल कैप शामिल हैं।
    2. एक एसेप्टिक वातावरण को बनाए रखने के लिए माउस और सभी सर्जिकल सामग्री पर 70% इथेनॉल स्प्रे करें।
    3. एनाल्जेसिया को प्रेरित करने के लिए, कार्प्रोफेन 5 मिलीग्राम / किग्रा चमड़े के नीचे (एससी) के साथ माउस को इंजेक्ट करें हर 12 घंटे21 सर्जरी से पहले 1 घंटे शुरू करें और सर्जरी के 3 दिनों के बाद तक जारी रहें।
    4. माउस को बेहोश करने के लिए, जानवर को एक प्रेरण कक्ष में रखें। 0.5% की दर से आइसोफ्लुरेन प्रवाह को खोलें और फिर धीरे-धीरे इसे लगभग 5 मिनट में 5% तक बढ़ाएं जब तक कि माउस ने अपना राइटिंग रिफ्लेक्स22 खो न दिया हो।
    5. प्रेरण कक्ष से जानवर को निकालें। तुरंत एक उचित आकार के नाक शंकु के साथ एक गैर-रिब्रीथिंग सर्किट के लिए जानवर को स्थानांतरित करें। सर्जरी के पूरे समय में आइसोफ्लुरेन 1% के साथ माउस संज्ञाहरण बनाए रखें।
    6. पुष्टि करें कि माउस पूरी तरह से अपनी पूंछ और पंजे चुटकी द्वारा anesthetized है। जब माउस पूंछ और पंजे को चुटकी लेने के लिए प्रतिक्रिया नहीं करता है, तो इसका मतलब है कि माउस पूरी तरह से एनेस्थेटिक है।
    7. कैंची का उपयोग करके माउस के सिर को शेव करें। क्लोरहेक्सिडीन 2% के साथ एक कपास झाड़ू का उपयोग करके माउस की त्वचा को साफ करें और सभी बालों को हटा दें।
    8. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में माउस के सिर को ठीक करें।
    9. एक कपास झाड़ू का उपयोग कर दोनों माउस आंखों में एक कॉर्नियल रक्षक रखें। अन्य कृन्तकों में तनाव प्रेरण को रोकने के लिए, सर्जरी कक्ष23 में किसी भी अन्य माउस की उपस्थिति से बचें।
  2. सर्जरी (लगभग 30 मिनट)
    1. माउस के सिर को 2% क्लोरहेक्सिडीन के तीन राउंड के साथ साफ करें, इसके बाद 70% इथेनॉल। सर्जिकल सामग्री का उपयोग करके खोपड़ी को बेनकाब करें और निम्नलिखित निर्देशांकों पर एक ड्रिल के साथ एक पतला छेद करें: एंटेरोपोस्टीरियर -2.8 मिमी, और औसत दर्जे की रेखा के संबंध में औसत दर्जे का 1.4 मिमी।
    2. छेद में एक 10 μL सिरिंज की सुई रखो और मस्तिष्क के अंदर सुई को धीरे-धीरे तब तक ले जाएं जब तक कि ड्यूरा24 के संबंध में -7.2 मिमी डोर्सोवेंट्रल पर न पहुंच जाए।
    3. ऊतक को थोड़ा सा व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए सुई को 2 मिनट के लिए अंतिम स्थिति में छोड़ दें, और फिर AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP), या वाहन (PHS 7.4 पर PBS; शाम सर्जरी) के 1 μL को 0.2 μL / 30 s की दर से सही सबस्टेंसिया निग्रा में इंजेक्ट करें।
    4. वायरल वैक्टर की डिलीवरी के बाद सुई को 5 मिनट के लिए उसी स्थिति में छोड़ दें और फिर इसे धीरे-धीरे वापस ले लें।
  3. सर्जरी के बाद (लगभग 5 मिनट)
    1. एक बाँझ रेशम-चोटी गैर अवशोषित टांका का उपयोग कर घाव बंद करो.
    2. माउस को घर के पिंजरे में रखें, इसे एक इलेक्ट्रिक गर्म गद्दे (25 डिग्री सेल्सियस) पर रखकर प्रीवार्ड करें।
      नोट: माउस को घर के पिंजरे में अकेले बनाए रखा जाना चाहिए जब तक कि यह बिना किसी कठिनाई के चलने में सक्षम न हो और घाव ठीक न हो जाए।

2. बीम परीक्षण का उपयोग कर मोटर प्रदर्शन का निर्धारण

  1. प्रशिक्षण (माउस प्रति लगभग 15 मिनट)
    1. स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के बारह सप्ताह बाद,25 से पहले वर्णित बीम परीक्षण के एक सरलीकृत संस्करण का उपयोग करके मोटर प्रदर्शन का आकलन करें। इस उद्देश्य के लिए, लंबाई में 25 सेमी और चौड़ाई में 3 सेमी के क्षैतिज बीम का उपयोग करें। बीम की सतह को 1 सेमी के वर्गों के साथ एक धातु ग्रिड के साथ कवर किया जाना चाहिए और बीम से ऊपर 1 सेमी ऊंचा होना चाहिए।
    2. माउस का एक वीडियो लें जो ग्रिड-सतह बीम को एक छोर से बीम के विपरीत छोर तक पार करता है, जहां घर का पिंजरा स्थित है। मोटर प्रदर्शन के निर्धारण से पहले 2 दिनों के लिए माउस को प्रशिक्षित करें।
    3. पहले दिन, माउस को ग्रिड के बिना बीम के माध्यम से पांच बार चलने के लिए प्रशिक्षित करें।
    4. दूसरे दिन, माउस को ग्रिड की उपस्थिति में बीम के माध्यम से चलने के लिए पांच बार प्रशिक्षित करें।
  2. परीक्षण (माउस प्रति लगभग 5 मिनट)
    1. तीसरे दिन, मोटर प्रदर्शन का मूल्यांकन करें। ऐसा करने के लिए, धीमी गति मोड में वीडियो देखकर बाएं पंजे या दाएं पंजे द्वारा अलग से की गई त्रुटियों की संख्या निर्धारित करें।
      नोट:: एक त्रुटि के रूप में परिभाषित किया गया है जब एक पंजा ग्रिड पर सही ढंग से कदम नहीं है और इसलिए, ग्रिड के पक्ष में या ग्रिड और बीम सतह के बीच दृश्यमान हो जाता है।

3. ऊतक प्रसंस्करण

  1. ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन (माउस प्रति लगभग 15 मिनट)
    1. माउस को बेहोश करने के लिए, केटामाइन (80 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण को इंजेक्ट करें इंट्रापेरिटोनियल रूप से (आईपी) 1 एमएल सिरिंज और 27 जी सुई26 का उपयोग करके।
    2. एक बार माउस पूरी तरह से anesthetized है (चरण 1.1.6. के रूप में पुष्टि की है), शल्य चिकित्सा सामग्री के साथ वक्ष खोलें और दिल को बेनकाब करें।
    3. फिर, दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक 21 जी सुई डालें (एक ड्रिल का उपयोग करके टिप को सपाट बनाएं)।
    4. एक पाइप के लिए सुई युग्मन द्वारा, एक peristaltic पंप का उपयोग कर 9.5 mL / मिनट की दर से PBS (pH 7.4) के 50 mL perfuse।
  2. मस्तिष्क को ठीक करना और क्रायोप्रोटेक्ट करना (मस्तिष्क प्रति लगभग 10 मिनट)
    1. कैंची और चिमटी का उपयोग करके मस्तिष्क को हटा दें, और फिर पीबीएस (पीएच 7.4) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 5 मिलीलीटर में विसर्जन करके इसे 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
    2. इसके बाद, 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज के 15 मिलीलीटर में निश्चित मस्तिष्क को रखें।
    3. फिर, मस्तिष्क को क्रायोप्रोटेक्शन समाधान के 4 मिलीलीटर (पीबीएस में 20% ग्लिसरीन और 2% डीएमएसओ) में रखें और मस्तिष्क को -80 डिग्री सेल्सियस पर सहेजें या अगले चरण में तुरंत इसका उपयोग करें।
  3. मस्तिष्क स्लाइस प्राप्त करना (मस्तिष्क प्रति लगभग 20 मिनट)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क को कोरोनल कटौती करने के लिए एक उचित स्थिति में एक क्रायोस्टेट में रखा गया है।
    1. एसएन स्लाइस प्राप्त करने के लिए, मस्तिष्क को 40 μm मोटे वर्गों में काटें जो -2.92 मिमी से शुरू होते हैं और -3.64 मिमी24 पर समाप्त होते हैं।
    2. 25,27,28 से पहले वर्णित एक एंटेरोपोस्टीरियर ऑर्डर के बाद 24-वेल प्लेट के एक कुएं (क्रायोप्रोटेक्शन समाधान के 1 एमएल युक्त) में प्रत्येक स्लाइस को काट लें।
    3. एसएन में इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (अनुभाग 4.) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण (अनुभाग 5.) करने के लिए, समान अंतराल (120 μm) पर लिए गए छह कोरोनल एसएन वर्गों का चयन करें जो नाभिक की पूरी रोस्ट्रोकॉडल सीमा (कुल में 720 μm) को कवर करते हैं, जैसा कि 25,27,28 से पहले वर्णित है।
    4. स्ट्रिएटल स्लाइस प्राप्त करने के लिए, मस्तिष्क को 40 μm मोटे वर्गों में काटें जो +1.34 मिमी से शुरू होते हैं और -0.26 मिमी24 पर समाप्त होते हैं।
    5. एक 2 एमएल क्रायोट्यूब (क्रायोप्रोटेक्शन समाधान के 1 एमएल युक्त) में प्रत्येक स्लाइस को एक एंटेरोपोस्टीरियर ऑर्डर के बाद काटें।
    6. स्ट्रिएटम में इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (अनुभाग 4.) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण (अनुभाग 5.) करने के लिए, एक समान अंतराल (320 μm) पर लिए गए पांच कोरोनल स्ट्रिएटल वर्गों का चयन करें जो नाभिक की पूरी रोस्ट्रोकॉडल सीमा (कुल मिलाकर 1600 μm) को कवर करते हैं।

4. इम्युनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लियोसिस (लगभग 2 दिन) को मापने के लिए

  1. स्ट्रिएटल या निग्राल स्लाइस के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए, एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में एक ही मस्तिष्क से पांच (स्ट्रिएटम) या छह (एसएन) स्लाइस के सेट को रखें।
  2. पीबीएस के 1 एमएल के साथ अनुभाग 3x को धोएं और फिर कमरे के तापमान पर मेथनॉल में 0.03% एच2ओ2 के 0.5 मिलीलीटर के साथ और अंतर्जात पेरोक्सीडेज गतिविधि को निष्क्रिय करने के लिए 30 मिनट के लिए आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ अनुभाग 3x को धोएं और 0.5 मिलीलीटर ब्लॉकिंग समाधान (4% बकरी सीरम, 0.05% ट्राइटन एक्स -100, और पीबीएस में 4% बीएसए) के साथ कमरे के तापमान पर और 40 मिनट के लिए आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
  4. इसके बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी tyrosine hydroxylase [TH] pAb पतला 1: 1000 [ तालिका 1 देखें]; या खरगोश विरोधी Iba1 एंटीबॉडी पतला 1:1000) कमरे के तापमान पर और रात भर आंदोलन के साथ युक्त ब्लॉकिंग समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट।
  5. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ अनुभाग 3x को धोएं और बायोटिनिलेटेड बकरी एंटी-खरगोश पीएबी (1: 500, तालिका 1 देखें) वाले ब्लॉकिंग समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट करें कमरे के तापमान पर और 2 घंटे के लिए आंदोलन के साथ।
  6. फिर, पीबीएस के 1 एमएल के साथ अनुभाग 3x को धोएं और पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एविडिन (1: 5000, तालिका 1 देखें) के 0.5 मिलीलीटर के साथ कमरे के तापमान पर समाधान को अवरुद्ध करने में और 90 मिनट के लिए आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
  7. पीबीएस के 1 एमएल के साथ अनुभाग 3x को धोएं और सब्सट्रेट समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट करें (0.03% एच2ओ2 / ट्रिज़्मा-एचसीएल बफर में 0.05% डायमिनोबेन्जिडीन पीएच 7.6 पर)। इस चरण के लिए दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहनें, क्योंकि डायमिनोबेन्ज़िडीन एक संभावित कार्सिनोजेन है।
  8. जब विशिष्ट धुंधला स्पष्ट होता है (आमतौर पर TH के लिए 30 सेकंड और Iba1 के लिए 5 मिनट), सब्सट्रेट समाधान को बाहर निकालें और कमरे के तापमान पर और आंदोलन के साथ पीबीएस के 1 एमएल के साथ अनुभाग 3x को धोएं। हमेशा एक ही प्रयोग में शामिल सभी दिमागों के स्लाइस के immunostaining बाहर ले लो एक साथ.
    नोट: टीएच का विशिष्ट धुंधला स्पष्ट है जब टीएच इम्युनोस्टेनिंग एसएन के क्षेत्र में दिखाई देता है, जो मस्तिष्क में एक विशेषता आकार प्रदर्शित करता है। Iba1 का विशिष्ट चिह्न निर्धारित किया जाता है जब Iba1 immunostaining विशिष्ट microglial आकार के साथ नियंत्रण मस्तिष्क स्लाइस पर दिखाई देता है, जो माइक्रोस्कोप अवलोकन पर पुष्टि की जाती है। इस तरह, आईएचसी विश्लेषण के लिए सब्सट्रेट प्रदर्शनी का सटीक समय हर एक प्रयोग के लिए निर्धारित किया जाता है।
  9. 0.05 M Tris (pH 7.6) में 0.2% जिलेटिन के समाधान का उपयोग करके कांच की स्लाइड पर मस्तिष्क वर्गों को माउंट करें। एक ही ग्लास स्लाइड पर रोस्ट्रोकडल क्रम में एक ही मस्तिष्क से प्राप्त पांच (स्ट्रिएटम) या छह (एसएन) स्लाइस के प्रत्येक सेट को रखें।
  10. एसएन में टीएच + न्यूरॉन्स की संख्या निर्धारित करें।
    1. एसएन में टीएच + न्यूरॉन्स को मापने के लिए, एक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 20x आवर्धन पर छह स्लाइस की तस्वीरें प्राप्त करें, जैसा कि 25,27,28 से पहले वर्णित है। रंग के निम्नलिखित समायोजन का उपयोग करें: रंग तापमान 3200 K, सियान-लाल 40%, मैजेंटा-हरा 39%, पीला-नीला 54%, गामा 0.5, कंट्रास्ट 37, चमक 13, संतृप्ति 5।
    2. छवि जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, विश्लेषण किए गए गोलार्ध में एसएन पार्स कॉम्पैक्टा की परिधि का चयन करें। वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र (वीटीए) से टीएच + न्यूरॉन्स के चयन से बचें।
    3. इसके बाद, सॉफ़्टवेयर को चयनित क्षेत्र की गणना करने के लिए कहें (आमतौर पर 0.04-0.07 मिमी2 / गोलार्ध, रोस्ट्रोकाउडल स्थिति के आधार पर)। फिर, मल्टीपॉइंट टूल का उपयोग करके, प्रत्येक एक टीएच + न्यूरॉन को एक डॉट के साथ टैग करें।
    4. बिंदु उपकरण का उपयोग करते हुए, सॉफ़्टवेयर को डॉट्स की कुल संख्या की गणना करने के लिए कहें। कुल डॉट्स (TH + न्यूरॉन्स) की संख्या और SNpc के क्षेत्र के साथ, TH + न्यूरॉन्स / मिमी2 के घनत्व की गणना करें।
    5. छह एसएन स्लाइस पर दोनों गोलार्धों में एक ही गणना को दोहराएं और फिर ipsilateral और contralateral पक्षों पर TH + न्यूरॉन्स / मिमी2 के माध्य की गणना करें।
  11. स्ट्रिएटम में सक्रिय माइक्रोग्लिया की संख्या निर्धारित करें
    1. स्ट्रिएटम में सक्रिय माइक्रोग्लिया को मापने के लिए, एक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 20x आवर्धन पर सभी पांच स्ट्रिएटल स्लाइस के लिए प्रत्येक गोलार्ध में दो तस्वीरें प्राप्त करें और चरण 4.10.1 में इंगित समान सेटिंग्स। छवि जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, हर एक तस्वीर में (660 μm x 877 μm के एक क्षेत्र को प्रदर्शित करते हुए), मल्टीपॉइंट टूल का उपयोग करके उच्च Iba1 तीव्रता और ameboid आकार को व्यक्त करने वाले हर एक सेल में एक डॉट के साथ टैग करें। बिंदु उपकरण का उपयोग करते हुए, सॉफ़्टवेयर को डॉट्स की कुल संख्या की गणना करने के लिए कहें।
    2. कुल डॉट्स की संख्या और फोटो के क्षेत्र के साथ, सक्रिय माइक्रोग्लिया (Iba1उच्च कोशिकाओं / मिमी 2) के घनत्व की गणना करें जैसा कि29 से पहले किया गया था।

लक्ष्य प्रतिजन युग्मित करने के लिए क्लोनालिटी मेजबान specie विशिष्ट प्रतिक्रियाशीलता * तनुकरण **
Tyrosine Hydroxylase N/A बहुक्लोनल खरगोश माउस, चूहा, मानव 1/200 - 1/1000
Iba1 N/A मोनोक्लोनल खरगोश माउस, चूहा, मानव 1/1000
ऐल्फा-सिन्यूक्लिन N/A मोनोक्लोनल खरगोश मानवीय 1/150
CD4 N/A मोनोक्लोनल चूहा चूहा 1/250
IgG (H+L) जैव-टिनीकृत बहुक्लोनल बकरी खरगोश 1/500
IgG (H+L) AlexaFluor 546 बहुक्लोनल बकरी खरगोश 1/500
IgG (H+L) AlexaFluor 647 बहुक्लोनल बकरी खरगोश 1/500
IgG (H+L) AlexaFluor 546 बहुक्लोनल बकरी चूहा 1/500

तालिका 1: एंटीबॉडी dilutions. एन / ए, लागू नहीं है। *, यह केवल तभी निर्दिष्ट किया जाता है जब माउस, चूहे और मानव के साथ प्रतिक्रियाशीलताएं होती हैं, भले ही अन्य प्रजातियों के साथ प्रतिक्रियाशीलता की परवाह किए बिना। **, एक एकल कमजोर पड़ने या एक कमजोर पड़ने की सीमा निर्दिष्ट की जाती है।

5. Immunofluorescence विश्लेषण nigrostriatal मार्ग (लगभग 2 दिन) में टी सेल घुसपैठ का मूल्यांकन करने के लिए

  1. स्ट्रिएटल या निग्राल स्लाइस पर hαSyn या TH / GFP के immunofluorescence विश्लेषण के लिए, एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में एक ही मस्तिष्क से पांच (स्ट्रिएटम) या छह (एसएन) स्लाइस के सेट को एक साथ रखें।
    1. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ अनुभाग 3x को धोएं और फिर 0.5 मिलीलीटर ब्लॉकिंग समाधान (0.3% ट्राइटन एक्स -100, 0.05% ट्वीन 20, और पीबीएस में 5% बीएसए) के साथ कमरे के तापमान पर और 40 मिनट के लिए आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
    2. इसके बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी TH pAb पतला 1:500; या खरगोश विरोधी hαSyn एंटीबॉडी पतला 1:150, तालिका 1 देखें) कमरे के तापमान पर और रात भर आंदोलन के साथ युक्त ब्लॉकिंग समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट करें।
  2. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ अनुभाग 3x को धोएं और एलेक्साफ्लोर 546-युग्मित एंटी-खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 500, तालिका 1 देखें) और 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई; 1: 1000) वाले ब्लॉकिंग समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट करें कमरे के तापमान पर और 2 घंटे के लिए आंदोलन के साथ। फिर, पीबीएस के 1 एमएल के साथ अनुभाग 3x धोएं।
  3. ऊपर वर्णित के रूप में कांच की स्लाइड्स पर मस्तिष्क वर्गों माउंट (चरण 4.9.). छवियों को एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया गया था जो एक बिजली की आपूर्ति इकाई के साथ युग्मित था।
  4. निग्राल स्लाइस पर टीएच / सीडी 4 / जीएफपी (फॉक्सपी 3) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए, एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में एक ही मस्तिष्क से छह (एसएन) स्लाइस का सेट रखें। पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ अनुभाग 3x को धोएं और फिर ब्लॉकिंग समाधान के 0.5 मिलीलीटर (0.5% ट्राइटन एक्स -100, पीबीएस में 0.5% मछली की त्वचा जिलेटिन) के साथ कमरे के तापमान पर और 2 घंटे के लिए आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश विरोधी TH pAb (1: 200, तालिका 1 देखें) और चूहा विरोधी CD4 ( 1: 250) 4 डिग्री सेल्सियस पर और रात भर आंदोलन के साथ युक्त ब्लॉकिंग समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट करें।
  6. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ अनुभाग 3x को धोएं और एलेक्साफ्लोर 647 (1: 500, तालिका 1 देखें) के लिए युग्मित एंटी-खरगोश युक्त ब्लॉकिंग समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट करें और एंटी-चूहा एलेक्साफ्लोर 546 (1: 500) को कमरे के तापमान पर और 2 घंटे के लिए आंदोलन के साथ युग्मित करें। फिर, पीबीएस के 1 एमएल के साथ अनुभाग 3x धोएं।
  7. एक ही ग्लास स्लाइड पर रोस्ट्रोकॉडल क्रम में एक ही मस्तिष्क से प्राप्त छह (एसएन) स्लाइस के प्रत्येक सेट को रखें और उन्हें फ्लोरोमाउंट जी का उपयोग करके माउंट करें। इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण से छवियों को प्राप्त करने के लिए तालिका 2 में इंगित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करें।
चैनल का नाम घन उत्सर्जन वेवलेंगट लुकअप तालिका नाम एक्सपोज़र समय लाभ रिज़ॉल्यूशन XY रिज़ॉल्यूशन Z
चैनल 1 Y5 700nm ग्रे 1,011.727 ms उच्च कूप क्षमता 2.237 um 24.444 um
चैनल 2 GFP 525nm हरा 326.851 ms उच्च कूप क्षमता 2.237 um 24.444 um
चैनल 3 TXR 630nm लाल 406.344 ms उच्च कूप क्षमता 2.237 um 24.444 um
चैनल 4 दापी 460nm नीला 91.501 ms उच्च कूप क्षमता 2.237 um 24.444 um

तालिका 2: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सेटिंग्स immunofluorescence विश्लेषण से छवियों के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. Ipsilateral और contralateral पक्षों से प्राप्त डेटा की तुलना करने के लिए, एक युग्मित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करें।
  2. AAV-hαSyn प्राप्त करने वाले चूहों से प्राप्त डेटा की तुलना करने के लिए और AAV-GFP या शाम सर्जरी प्राप्त करने वाले चूहों से, एक unpaired दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करें। जब P मान 0.05 <, तो महत्वपूर्ण अंतरों पर विचार करें.

Representative Results

nigrostriatal मार्ग के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में AAV वैक्टर के सही वितरण को मान्य करना
न्यूक्ल्यूक्लिन पैथोलॉजी द्वारा बढ़ावा दिए गए न्यूरोइंफ्लेमेशन, न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, एसएन 16,17,30,31 में एचएक्ससिन एन्कोडिंग एएवी के एकतरफा स्टीरियोटैक्सिक वितरण से प्रेरित पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल का उपयोग किया गया था (पूरक चित्रा 1 में प्रयोगात्मक डिजाइन देखें) ). Nigrostriatal मार्ग के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में AAV वैक्टर के सही वितरण को मान्य करने के लिए, AAV एन्कोडिंग GFP (AAV-GFP) को SN में इंजेक्ट किया गया था, और 12 सप्ताह बाद, GFP प्रतिदीप्ति और tyrosine hydroxylase (TH) का विश्लेषण SN और striatum में immunofluorescence द्वारा किया गया था। जीएफपी से जुड़े प्रतिदीप्ति को विशेष रूप से ipsilateral पक्ष पर देखा गया था, और एसएन और स्ट्रिएटम दोनों में टीएच के साथ महत्वपूर्ण सहस्थानीयकरण था, जो निग्रोस्ट्रिएटल मार्ग (चित्रा 1) के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में एएवी वैक्टर के सही वितरण का संकेत देता है।

Figure 1
चित्रा 1: nigrostriatal मार्ग में AAV-GFP के वितरण का विश्लेषण। चूहों को एएवी-जीएफपी (1 x 1010 वीजी / माउस) प्राप्त हुआ और 12 सप्ताह बाद बलिदान कर दिया गया, और टीएच को (ए) एसएन (स्केल बार 118 μm हैं) और (बी) स्ट्रिएटम (स्केल बार 100 μm हैं) में immunostained था। TH- और GFP-संबद्ध प्रतिदीप्ति का विश्लेषण एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था। नाभिक को DAPI के साथ दाग दिया गया था। TH (लाल), GFP (हरा), और DAPI (नीला) के विलय या एकल धुंधला की प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

AAV-hαSyn द्वारा प्रेरित पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल में न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि को प्रेरित करने के लिए प्रशासित वायरल वेक्टर की खुराक की स्थापना
AAV-hαSyn की खुराक का परीक्षण करने के लिए hαSyn के एक महत्वपूर्ण overexpression को प्रेरित करने के लिए आवश्यक है जो nigral डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के न्यूरोडीजेनेरेशन को बढ़ावा देता है, विभिन्न खुराक (1 x 108 वायरल जीनोम [vg]/माउस, 1 x 109 vg/mouse, या 1 x10 10 vg/mouse) AAV-hαSyn को इंजेक्ट किया गया था, और 12 सप्ताह बाद, hαSyn और TH की सीमा का मूल्यांकन nigrostriatal pathway में किया गया था। यद्यपि HαSyn सभी खुराक SN (चित्रा 2) में परीक्षण के साथ स्पष्ट था, केवल 1 x 1010 vg / माउस प्राप्त करने वाले चूहों ने स्ट्रिएटम (चित्रा 3) में स्पष्ट hαSyn को प्रस्तुत किया। इसके अलावा, AAV-hαSyn के1 x 10 10 vg / माउस प्राप्त करने वाले चूहों ने SN (चित्रा 4A, B) में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स का एक महत्वपूर्ण नुकसान प्रदर्शित किया। यद्यपि एएवी-जीएफपी के1 x 10 10 वीजी / माउस प्राप्त करने वाले चूहों ने न्यूरोनल हानि (चित्रा 4 ए, बी) की कम डिग्री (~ 20%) प्रदर्शित की, एएवी-hαSyn की एक ही खुराक प्राप्त करने वाले चूहों ने निग्राल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (चित्रा 4 सी) के न्यूरोडीजेनेरेशन की काफी उच्च डिग्री प्रस्तुत की। तदनुसार, AAV-hαSyn के 1 x10 10 vg / माउस का उपयोग करके आगे के प्रयोग किए गए थे। इसके अलावा, बीम परीक्षण (चित्रा 5 ए) का उपयोग करके एएवी-एचजेडसिन की विभिन्न खुराक प्राप्त करने वाले चूहों में मोटर हानि की सीमा निर्धारित की गई थी, जैसा कि25 से पहले वर्णित है। मोटर प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण कमी विशेष रूप से बीम परीक्षण में AAV-hαSyn के1 x 10 10 vg / माउस के साथ पाया गया था, जब दाएं और बाएं पैड (चित्रा 5B) द्वारा की गई त्रुटियों की संख्या की तुलना करते समय और नियंत्रण वेक्टर AAV-GFP (चित्रा 5C) प्राप्त करने वाले चूहों की तुलना में AAV-hαSyn प्राप्त करने वाले चूहों की कुल संख्या की तुलना में। तदनुसार, AAV-hαSyn के 1 x10 10 vg / माउस का उपयोग करके आगे के प्रयोग किए गए थे।

Figure 2
चित्रा 2: AAV-hαSyn की विभिन्न खुराक के साथ इलाज चूहों के एसएन में मानव α-synuclein अभिव्यक्ति का विश्लेषण। चूहों को AAV-hαSyn (A) 1 x 1010 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse, या (C) 1 x 108 vg/mouse पर प्राप्त हुआ और 12 सप्ताह बाद बलिदान कर दिया गया, और hαSyn अभिव्यक्ति का विश्लेषण SN में immunofluorescence द्वारा epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया गया। नाभिक को DAPI के साथ दाग दिया गया था। hαSyn (लाल) या DAPI (नीले) के विलय या एकल धुंधला की प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। स्केल बार 118 μm हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: AAV-hαSyn की विभिन्न खुराक के साथ इलाज चूहों के striatum में मानव α-synuclein अभिव्यक्ति का विश्लेषण। चूहों को (ए) 1 x 10 10 vg/ माउस, (B)1 x 10 9 vg/mouse, या (C) 1 x 108 vg/mouse) पर AAV-hαSyn प्राप्त हुआ और 12 सप्ताह बाद बलिदान कर दिया गया, और hαSyn अभिव्यक्ति का विश्लेषण एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्ट्रिएटम में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया। नाभिक को DAPI के साथ दाग दिया गया था। hαSyn (लाल) या DAPI (नीले) के विलय या एकल धुंधला की प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। स्केल बार 100 μm हैं। मर्ज की गई छवियों के ऊपरी-दाएं कोने पर सम्मिलित करना उच्च आवर्धन में रुचि का एक क्षेत्र दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: चूहों में एसएन के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स का नुकसान एएवी-hαSyn या नियंत्रण वेक्टर की विभिन्न खुराक के साथ इलाज किया जाता है। चूहों को AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse, या 1 x 108 vg/mouse) या AAV-GFP (1 x 1010 vg/mouse) प्राप्त हुआ और 12 सप्ताह बाद बलिदान किया गया, और TH का विश्लेषण SNpc में immunohistochemistry द्वारा किया गया। (ए) प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार, 100 μm. (B,C) न्यूरॉन्स के घनत्व को TH + न्यूरॉन्स / mm2 की संख्या के रूप में परिमाणित किया गया था। डेटा SEM ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। n = 3-8 चूहों प्रति समूह। (बी) contralateral पक्षों के साथ ipsilateral की तुलना दो पूंछ जोड़ी छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था। (ग) एएवी-एचαSyn या एएवी-जीएफपी के 1 x10 10 vg /माउस प्राप्त करने वाले चूहों से ipsilateral पक्षों की तुलना की गई थी। (B, C) जबकि सफेद सलाखों AAV-hαSyn प्राप्त चूहों के ipsilateral पक्ष पर TH + न्यूरॉन्स के परिमाणीकरण का संकेत देते हैं, हरे रंग की सलाखों AAV-GFP प्राप्त करने वाले चूहों के ipsilateral पक्ष पर TH + न्यूरॉन्स के परिमाणीकरण का संकेत देते हैं। ग्रे सलाखों इसी समूह के contralateral पक्ष पर TH + न्यूरॉन्स के परिमाणीकरण का संकेत देते हैं। तुलना एक दो पूंछ वाले अनपेयर्ड छात्र के टी-टेस्ट द्वारा की गई थी। * पी < 0.05; ** पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: AAV-hαSyn की विभिन्न खुराक के साथ इलाज चूहों में मोटर प्रदर्शन का विश्लेषण। चूहों को AAV-hαSyn या AAV-GFP की विभिन्न खुराक (1 x 10 10 10 vg / माउस, 1 x 109 vg / माउस, या 1 x 108 vg / माउस) प्राप्त हुई, और 12 सप्ताह बाद, मोटर प्रदर्शन का मूल्यांकन बीम परीक्षण द्वारा किया गया था। (ए) बीम पर चलने वाले माउस की छवि। (बी) बाएं अंगों (contralateral) बनाम दाएं अंगों (ipsilateral) द्वारा की गई त्रुटियों की संख्या को AAV-hαSyn प्राप्त करने वाले चूहों के समूहों में परिमाणित किया गया था। (सी) त्रुटियों की कुल संख्या की तुलना एएवी-एचजेडसिन या एएवी-जीएफपी की एक ही खुराक प्राप्त करने वाले विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच की गई थी। डेटा SEM ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। n = 3-5 चूहों प्रति समूह। तुलना (बी) द्वारा की गई थी एक युग्मित दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट या (सी) द्वारा एक अनपेयर्ड दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट। * पी < 0.05; ** पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

AAV-αSyn द्वारा प्रेरित पार्किंसंस रोग मॉडल के कैनेटीक्स की स्थापना
न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि के एक महत्वपूर्ण स्तर को प्रेरित करने के लिए उपयोग की जाने वाली उचित AAV-hαSyn खुराक को निर्धारित करने के बाद, hαSyn overexpression की शुरुआत को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किए गए थे। इस उद्देश्य के लिए, चूहों को AAV-hαSyn या शाम सर्जरी के1 x 10 10 vg / माउस के साथ इलाज किया गया था। hαSyn अभिव्यक्ति की सीमा का विश्लेषण स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के बाद सप्ताह 2-5 के दौरान प्रति सप्ताह एक बार एसएन में किया गया था ( पूरक चित्रा 2 में प्रयोगात्मक डिजाइन देखें)। परिणामों से पता चलता है कि, hαSyn अभिव्यक्ति के बावजूद सर्जरी के बाद 2 सप्ताह की शुरुआत में कम स्तर पर पता लगाया जा रहा है, hαSyn क्लस्टर स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी (चित्रा 6) के बाद सप्ताह 5 में दिखाई दिए।

Figure 6
चित्रा 6: AAV-hαSyn के साथ इलाज चूहों के एसएन में मानव α-synuclein अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम का विश्लेषण। चूहों को AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse) या सिर्फ शाम स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी प्राप्त हुई, और SN में hαSyn की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया (A) 2 सप्ताह, (B) 3 सप्ताह, (C) 4 सप्ताह, या (D) 5 सप्ताह बाद एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके immunofluorescence द्वारा। नाभिक को DAPI के साथ दाग दिया गया था। hαSyn (लाल) या DAPI (नीले) के विलय या एकल धुंधला की प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। स्केल सलाखों, 100 μm. मर्ज की गई छवियों के ऊपरी-दाएं कोने पर सम्मिलित करना उच्च आवर्धन में रुचि का एक क्षेत्र दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसके बाद, एएवी-hαSyn के स्टीरियोटैक्सिक वितरण के बाद केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में न्यूरोइंफ्लेमेशन और टी-सेल घुसपैठ का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त समय बिंदुओं को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किए गए थे। AAV-hαSyn के साथ चूहों के उपचार के बाद microglial सक्रियण के शिखर को निर्धारित करने के लिए, striatum में Iba1 के उच्च स्तर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की सीमा का मूल्यांकन स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के बाद सप्ताह 2-15 के दौरान प्रति सप्ताह एक बार किया गया था। परिणाम AAV-hαSyn उपचार (चित्रा 7) के बाद 15 सप्ताह के बाद चूहों के contralateral पक्ष की तुलना में ipsilateral पक्ष के microglial सक्रियण में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाते हैं। Treg (CD4 + Foxp3+) कोशिकाओं की संख्या SNpc में घुसपैठ भी immunofluorescence द्वारा AAV-hαSyn के stereotaxic वितरण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर मूल्यांकन किया गया था confocal माइक्रोस्कोपी अवलोकन के बाद. परिणाम बताते हैं कि एसएनपीसी में ट्रेग घुसपैठ का चरम सर्जरी के बाद 11 सप्ताह में था, जबकि मस्तिष्क के इस क्षेत्र में घुसपैठ करने वाले ट्रेग की सीमा सर्जरी के बाद सप्ताह 8 या सप्ताह 13 में कम थी (चित्रा 8)। कोई CD4 + T कोशिकाओं striatum घुसपैठ (डेटा नहीं दिखाया गया है) का पता चला था। कुल मिलाकर, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि, AAV-hαSyn के1 x 10 10 vg / माउस का उपयोग करके, neuroinflammation का विश्लेषण करने के लिए सबसे उपयुक्त समय बिंदु स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के बाद सप्ताह 15 है, जबकि सीएनएस में टी-सेल घुसपैठ का विश्लेषण करने के लिए एक उचित समय बिंदु AAV-hαSyn उपचार के बाद सप्ताह 11 लगता है।

Figure 7
चित्रा 7: AAV-hαSyn के साथ संक्रमित चूहों में microglial सक्रियण के समय पाठ्यक्रम का विश्लेषण। चूहों को AAV-hαSyn (1 x 1010 vg /mouse) प्राप्त हुआ, और माइक्रोग्लियल सक्रियण का मूल्यांकन सर्जरी के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर स्ट्रिएटम में Iba1 के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण द्वारा किया गया था। (ए) चूहों से Iba1 के इम्युनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण की प्रतिनिधि अवलोकन छवियां AAV-hαSyn के साथ टीकाकरण के बाद 5 सप्ताह, 10 सप्ताह या 15 सप्ताह का बलिदान किया गया है। स्केल बार, 110 μm. (B) सक्रिय माइक्रोग्लिया के घनत्व को प्रति क्षेत्र Iba1 और ameboid आकार के उच्च स्तर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की संख्या के रूप में परिमाणित किया गया था। डेटा SEM ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। n = 3 चूहों प्रति समूह। प्रत्येक समूह में ipsilateral और contralateral Iba1 के बीच सांख्यिकीय अंतर निर्धारित करने के लिए एक दो-पूंछ वाले युग्मित छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। * पी < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: AAV-hαSyn के साथ संक्रमित चूहों के एसएन में CD4 + T-सेल घुसपैठ के समय पाठ्यक्रम का विश्लेषण। Foxp3gfp रिपोर्टर चूहों AAV-hαSyn (1 x 1010 vg / माउस) प्राप्त किया। Foxp3 को व्यक्त करने वाली CD4+ T-कोशिकाओं की उपस्थिति और TH+ न्यूरॉन्स की उपस्थिति का विश्लेषण विभिन्न समय बिंदुओं (सप्ताह 8, सप्ताह 11, और सर्जरी के बाद सप्ताह 13) पर किया गया था। (ए) एकल इम्युनोस्टेनिंग या मर्ज के लिए प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। स्केल बार, 100 μm. (B) SN में प्रति क्षेत्र CD4+ Foxp3+ T कोशिकाओं की संख्या को परिमाणित किया गया था। डेटा प्रति समूह 3 चूहों से SEM ± मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। * पी<0.05, ipsilateral बनाम contralateral CD4 + Foxp3 + टी कोशिकाओं दो पूंछ छात्र टी परीक्षण द्वारा. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: synuclein विकृति, neurodegeneration, और मोटर हानि पर AAV वैक्टर की विभिन्न खुराक के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन। जंगली प्रकार के पुरुष C57BL / 6 चूहों को एनेस्थेटिक किया गया था और विभिन्न खुराक (1 x 1010 vg / माउस, 1 x 10 9 vg / माउस, या 1 x 108 vg / माउस) के विभिन्न खुराक (1 x 10 109 vg / माउस) के स्टीरियोटैक्सिक इनोक्यूलेशन प्राप्त किया गया था, जो मानव α-सिन्यूक्लिन (AAV-hαSyn) या eGFP (AAV-GFP) को सही सबस्टैंटिया निग्रा (एसएन) में CBA प्रमोटर के नियंत्रण में एन्कोडिंग करता है। 12 सप्ताह के बाद, SN और striatum (Str) में GFP और hαSyn की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन immunofluorescence (IF) द्वारा किया गया था, tyrosine hydroxylase positive (TH+) कोशिकाओं को SN में immunohistochemistry (IHC) द्वारा परिमाणित किया गया था, और बीम परीक्षण द्वारा मोटर प्रदर्शन का मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में चूहों की संख्या कोष्ठक में इंगित की गई है। * उन समूहों को इंगित करता है जहां विश्लेषण से पहले एक माउस की मृत्यु हो गई थी। प्रत्येक विश्लेषण कोष्ठक में पेपर के शरीर से आकृति की संख्या को इंगित करता है जहां संबंधित परिणाम दिखाए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: टी-सेल घुसपैठ, neuroinflammation, और hαSyn अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स का निर्धारण करने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन। Foxp3gfp रिपोर्टर चूहों anesthetized थे और AAV (1 x 1010 vg / माउस) एन्कोडिंग मानव α-synuclein (AAV-hαSyn) के स्टीरियोटैक्सिक इनोक्यूलेशन प्राप्त सही substantia nigra (एसएन) या शाम सर्जरी (PBS) में CBA प्रमोटर के नियंत्रण में। चूहों को अलग-अलग समय बिंदुओं पर बलिदान किया गया था, और एसएन और स्ट्रिएटम में hαSyn की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF), GFP (Foxp3), CD4, और tyrosine hydroxylase positive (TH+) कोशिकाओं द्वारा किया गया था, और Iba1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण स्ट्रिएटम (Str) में IMNOHIStochemistry (IHC) द्वारा किया गया था। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में चूहों की संख्या इंगित की जाती है। प्रत्येक विश्लेषण में शामिल समय बिंदुओं की सीमा इंगित की जाती है। प्रत्येक विश्लेषण कोष्ठक में पेपर के शरीर से आकृति की संख्या को इंगित करता है जहां संबंधित परिणाम दिखाए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

यहां विश्लेषण किए गए न्यूरोडीजेनेरेशन के माउस मॉडल पार्किंसंस रोग के पैथोफिजियोलॉजी में शामिल कई महत्वपूर्ण पहलुओं का अध्ययन करने में मदद कर सकते हैं, जिसमें αSyn पैथोलॉजी और माइक्रोग्लियल सक्रियण में शामिल तंत्र, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के विनियमन में परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली की भागीदारी, और न्यूरोडीजेनेरेशन के तंत्र शामिल हैं। αSyn विकृति में शामिल तंत्रों में से वे उपकोशिकीय तंत्र हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल, लाइसोसोमल, या प्रोटीसोमल डिसफंक्शन से जुड़े हैं, जो एसएन2 के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में αSyn के अत्यधिक भार की उपस्थिति में हैं। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि, AAV-मध्यस्थता ट्रांसडक्शन द्वारा प्रेरित hαSyn अभिव्यक्ति के अलावा, अंतर्जात माउस αSyn भी कुल αSyn अभिव्यक्ति के भार में योगदान देता है। ट्रांसजेनिक चूहों को अधिक व्यक्त माउस αSyn hαSyn के overexpression के आधार पर उन माउस मॉडल के लिए इसी तरह synuclein विकृति, neuropathology, और मोटर हानि विकसित करतेहैं। माइक्रोग्लियल सक्रियण के बारे में, वर्तमान माउस मॉडल का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है कि साइटोकिन्स, न्यूरोट्रांसमीटर, एस्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स, रक्त-मस्तिष्क बाधा और टी कोशिकाओं जैसे विभिन्न आणविक और सेलुलर खिलाड़ी प्रो-इंफ्लेमेटरी या विरोधी भड़काऊ कार्यात्मक फेनोटाइप के अधिग्रहण को कैसे विनियमित कर सकते हैं 8,10,11 . यह मॉडल परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का भी गठन करता है, जिसमें न केवल टी कोशिकाएं बल्कि मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल भी शामिल हैं, जो न्यूरोइंफ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन की प्रक्रियाओं पर भी शामिल हैं निग्रॉल न्यूरॉन्स 11,33,34। अंत में, यह माउस मॉडल विवो में न्यूरोडीजेनेरेशन के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली का भी प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें आंतरिक सेलुलर प्रक्रियाओं से प्रेरित लोग शामिल हैं, जैसे कि ऑक्सीडेटिव तनाव, ऊर्जा घाटे, और क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल 2, या बाहरी खिलाड़ियों द्वारा लगाए गए, जैसे कि माइक्रोग्लियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित न्यूरोटॉक्सिक कारक8, 28,29,35.

इस माउस मॉडल की एक सीमा इस बात का अध्ययन है कि अतिरिक्त-सेरेब्रल स्थानों में αSyn का पैथोलॉजिकल एकत्रीकरण पार्किंसंस रोग36 के विकास में प्रारंभिक चरणों का गठन कैसे कर सकता है। इस संबंध में, बढ़ते सबूत हैं जो यह दर्शाते हैं कि, निग्राल न्यूरॉन्स और मोटर हानि के न्यूरोडीजेनेरेशन से पहले, αSyn पैथोलॉजी आंत म्यूकोसा और घ्राण उपकला36 में शुरू होती है और, शायद, αSyn-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रिया के साथ-साथ12। इसके बाद, αSyn समुच्चय वेगस तंत्रिका के माध्यम से मस्तिष्क स्टेम में स्थानांतरित हो जाएगा, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स12 के न्यूरोइंफ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन को ट्रिगर करेगा। यद्यपि AAV-hαSyn मॉडल पार्किंसंस रोग के अधिकांश पहलुओं को दोहराता है, इस मॉडल में अतिरिक्त-सेरेब्रल स्थानों में αSyn के पैथोलॉजिकल एकत्रीकरण की कोई स्पष्ट भागीदारी नहीं है। पार्किंसंस रोग के इन पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त hαSyn पैथोलॉजी को शामिल करने वाला एक वैकल्पिक मॉडल ट्रांसजेनिक चूहों को Thy1 प्रमोटर, Thy1-SNCA मॉडल37 के नियंत्रण में hαSyn को अतिरंजित कर सकता है, जिसमें रोग का विकास आंत माइक्रोबायोटा पर निर्भर है और इसमें एक स्पष्ट जठरांत्र संबंधी हानिशामिल है 38।

यद्यपि यह पार्किंसंस रोग के पैथोफिजियोलॉजी से जुड़ी विभिन्न प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए सहायक है, वर्तमान माउस मॉडल में महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं जिन्हें बारीकी से जांचा जाना चाहिए, जिसमें संबंधित स्थानिक निर्देशांक में वायरल वैक्टर का सही वितरण, न्यूरॉन्स में hαSyn की चयनात्मक अभिव्यक्ति (जो एएवी सीरोटाइप और वेक्टर निर्माण पर निर्भर करता है), शामिल है। और पार्किंसंसियन फेनोटाइप का विश्लेषण करने से पहले उचित एएवी खुराक और समय। एसएन में वायरल वैक्टर के उचित वितरण का विश्लेषण आवश्यक है, क्योंकि एसएन के सही स्थानिक निर्देशांक का उपयोग पर्याप्त नहीं हो सकता है जब सुई पूरी तरह से सीधी नहीं होती है, जो कभी-कभी मानव आंख के लिए अगोचर होती है। इसके अलावा, एएवी वैक्टर का प्रसार एएवी सेरोटाइप39 पर निर्भर करता है। इन कारणों से, एसएन के क्षेत्र वाले मस्तिष्क स्लाइस में जीएफपी के अवलोकन के बाद इंजेक्ट किए गए एएवी-जीएफपी वैक्टर के सही वितरण और प्रसार की जांच करने के लिए आवधिक गुणवत्ता नियंत्रण करना आवश्यक है।

न्यूरॉन्स में hαSyn की चयनात्मक अभिव्यक्ति के बारे में, सिद्धांत रूप में, hαSyn की अभिव्यक्ति को न्यूरॉन्स के लिए चयनात्मक प्रमोटर द्वारा नियंत्रित करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है या, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के लिए भी अधिक सटीक, चयनात्मक, जैसे कि एएवी वैक्टर में टीएच प्रमोटर का उपयोग डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स40 में जीन की चयनात्मक अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए . हालांकि, यह रणनीति तब काम नहीं करती है जब जो मांग की जाती है वह ब्याज के जीन का ओवरएक्सप्रेशन है। इस कारण से, वर्तमान मॉडल में, एक मजबूत प्रमोटर (डाउनस्ट्रीम जीन की उच्च अभिव्यक्ति को प्रेरित करने वाला एक प्रमोटर) और न्यूरोनल ट्रोपिज़्म के साथ एएवी सेरोटाइप का उपयोग करना आवश्यक है। इस अध्ययन में, CBA प्रमोटर का उपयोग hαSyn के overexpression को प्रेरित करने के लिए एक मजबूत प्रमोटर के रूप में किया गया था, और AAV5 serotype का उपयोग वायरल वेक्टर के लिए किया गया था। इस सीरोटाइप का उपयोग माउस और चूहे के न्यूरॉन्स41,42 को ट्रांसड्यूस करने के लिए पहले किया गया है। यहां, परिणामों ने प्रदर्शित किया कि, चूहों के एसएन में एएवी 5-जीएफपी के वितरण के 12 सप्ताह बाद, हरे रंग की प्रतिदीप्ति एसएन और स्ट्रिएटम (चित्रा 1) दोनों के ipsilateral पक्ष पर चुनिंदा रूप से मौजूद थी, जो निग्रोस्ट्रियाटल मार्ग के न्यूरॉन्स के कुशल ट्रांसडक्शन का संकेत देती है।

पार्किंसंस रोग के इस माउस मॉडल का एक और महत्वपूर्ण पहलू सर्जरी के बाद एक विशेष प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक समय बिंदु है। इस संबंध में, यह काम पैथोलॉजी में शामिल विभिन्न प्रक्रियाओं का एक गतिज अध्ययन दिखाता है। चूंकि प्रति माउस दिए गए वायरल जीनोम की खुराक के साथ मुख्य समय बिंदु बदलते हैं, इसलिए एएवी के सीरोटाइप का उपयोग किया जाता है, या यहां तक कि एएवी के बैच के साथ भी उपयोग किया जाता है, टीएच + न्यूरॉन्स और मोटर हानि के महत्वपूर्ण नुकसान को प्रेरित करने के लिए आवश्यक एएवी-αSyn की मात्रा का एक खुराक-प्रतिक्रिया विश्लेषण पहली बार किया गया था। पिछले अध्ययनों ने महत्वपूर्ण मोटर हानि और चूहों में एएवी-αSyn इंजेक्शन के 12 सप्ताह के बाद TH + न्यूरॉन्स के नुकसान को 6 x 108-3 x 1010 प्रति माउस 16,17,30,31 प्रति वायरल जीनोम से लेकर खुराक पर चूहों में दिखाया है। तदनुसार, AAV-hαSyn की खुराक nigrostriatal मार्ग में hαSyn अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया, TH + न्यूरॉन्स के नुकसान, और चूहों में मोटर हानि प्रति माउस 1 x 108-1 x 1010 वायरल जीनोम से लेकर। इसके अलावा, यह नियंत्रित करने के लिए कि टीएच + न्यूरॉन्स और मोटर हानि के नुकसान को एसएन में एचजेडसिन के ओवरएक्सप्रेशन द्वारा प्रेरित किया गया था और एसएन के न्यूरॉन्स के एएवी संक्रमण द्वारा नहीं, नियंत्रण समूहों को शामिल किया गया था जिसमें एक रिपोर्टर जीन (एएवी-ईजीएफपी) के लिए एएवी कोडिंग को चूहों के एसएन में एकतरफा वितरित किया गया था और न्यूरोडीजेनेरेशन और मोटर हानि निर्धारित की गई थी। परिणामों से पता चला है कि, स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के 12 सप्ताह बाद, माउस प्रति 1 x10 10 वायरल जीनोम AAV5-hαSyn की एक उचित खुराक थी, क्योंकि इस वायरल लोड को प्राप्त करने वाले चूहों ने nigrostriatal Pathway (चित्रा 2 और चित्रा 3), TH + न्यूरॉन्स (चित्रा 4) का नुकसान, और मोटर हानि (चित्रा 5) में महत्वपूर्ण hαSyn प्रदर्शित किया। इसके विपरीत, AAV5-hαSyn की कम खुराक (माउस प्रति 1 x 108 वायरल जीनोम और प्रति माउस 1 x 109 वायरल जीनोम) इन सभी मापदंडों में महत्वपूर्ण परिवर्तनों तक पहुंचने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं थे (आंकड़े 2-4)। ध्यान दें, माउस प्रति 1 x10 10 वायरल जीनोम पर एएवी-जीएफपी के प्रशासन ने कम (~ 20%) को प्रेरित किया, लेकिन निग्राल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के टीएच + न्यूरॉन्स के नुकसान की महत्वपूर्ण डिग्री (चित्रा 4 ए, बी)। यह परिणाम इस मॉडल41 का उपयोग करके पिछले अवलोकनों से सहमत है और शायद एसएन में एएवी वैक्टर के प्रशासन से प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन के निम्न स्तर का परिणाम है। फिर भी, टीएच + न्यूरॉन्स के नुकसान की सीमा एएवी 5-एचएक्ससिन प्राप्त करने वाले चूहों में एएवी-जीएफपी (चित्रा 4 सी) की समान खुराक प्राप्त करने वालों की तुलना में काफी अधिक थी। ध्यान दें, hαSyn अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स न केवल transduction की दक्षता पर निर्भर करते हैं, बल्कि AAV प्रसार39 की सीमा पर भी निर्भर करते हैं। चूंकि एएवी प्रसार एएवी सेरोटाइप पर निर्भर करता है, इसलिए इस पशु मॉडल में सटीक कुंजी समय बिंदु एएवी 5 से अलग एक और एएवी सीरोटाइप का उपयोग करते समय भिन्न हो सकते हैं।

इसके बाद, इस माउस मॉडल में प्रमुख समय बिंदुओं को निर्धारित करने के लिए प्रति माउस 1 x10 10 वायरल जीनोम का उपयोग करके एक गतिज विश्लेषण किया गया था। चूंकि वर्तमान साक्ष्य ने कुछ शुरुआती लक्षण दिखाए हैं जो मोटर हानि से पहले दिखाई देते हैं, जो पार्किंसंस रोग43,44 के शुरुआती निदान की अनुमति देगा, इन प्रयोगों ने उस समय बिंदु को खोजने की मांग की जिस पर hαSyn अभिव्यक्ति पहले से ही स्पष्ट थी, लेकिन मोटर हानि की अनुपस्थिति में। परिणामों से पता चलता है कि एसएन में hαSyn अभिव्यक्ति की शुरुआत AAV-hαSyn (चित्रा 6) के स्टीरियोटैक्सिक वितरण के 5 सप्ताह बाद थी। यह समय बिंदु एक दिलचस्प अस्थायी बिंदु का गठन करने के लिए neuroinflammatory और neurodegenerative प्रक्रियाओं को रोकने के लिए सिलवाया उपचार प्रशासन शुरू करने के लिए. यहां निर्धारित अन्य महत्वपूर्ण समय बिंदु न्यूरोइन्फ्लेमेशन प्रक्रिया से जुड़ी दो महत्वपूर्ण घटनाओं के लिए चरम समय थे: वह समय जिस पर माइक्रोग्लिया सक्रियण की अधिकतम डिग्री तक पहुंचता है और एसएन में अधिकतम टी-सेल घुसपैठ का समय होता है। परिणामों ने अधिकतम माइक्रोग्लियल सक्रियण की दो तरंगों तक पहुंचने की प्रवृत्ति के साथ एक वक्र दिखाया, पहला सर्जरी के बाद 10 सप्ताह में और दूसरा सर्जरी के बाद 15 सप्ताह में (चित्रा 7)। टी-सेल घुसपैठ के गतिज विश्लेषण ने स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी (चित्रा 8) के 11 सप्ताह बाद एसएन में ट्रेग घुसपैठ के चरम समय को दिखाया। हैरानी की बात है, कोई भी प्रभावक टी कोशिकाओं (CD4 + Foxp3-) का विश्लेषण समय सीमा (सर्जरी के बाद सप्ताह 8-13) के दौरान एसएन में घुसपैठ करने का पता चला था। कुल मिलाकर, ये परिणाम इस प्रीक्लिनिकल मॉडल का उपयोग करके एसएन में न्यूरोइंफ्लेमेशन की प्रक्रिया को रोकने और टी-सेल घुसपैठ को क्षीण करने की दिशा में तैयार किए गए उपचारों को प्रशासित करना शुरू करने के लिए समय का एक उचित फ्रेम सुझाते हैं, जो सर्जरी के बाद सप्ताह 5 (hαSyn overexpression की शुरुआत) और सर्जरी के बाद सप्ताह 10 (न्यूरोइंफ्लेमेशन और टी-सेल घुसपैठ की पहली लहर) (चित्रा 9) के बीच होता है।

Figure 9
चित्र 9: इस पशु मॉडल के लिए पाए गए मुख्य समय बिंदुओं का सारांश। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वित्तीय या गैर-वित्तीय प्रतिस्पर्धी हितों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था।

Acknowledgments

हम हमारे पशु सुविधा में उनकी मूल्यवान पशु चिकित्सा सहायता के लिए डॉ Sebastián Valenzuela और डॉ Micaela Ricca धन्यवाद. इस काम को "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (Fundación Ciencia & Vida के लिए), और मस्तिष्क स्वास्थ्य और चयापचय के लिए Geroscience केंद्र, FONDAP-15150012 द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को FONDECYT-1210013 (आरपी के लिए) और FONDECYT-1150766 (एफसी के लिए) अनुदान द्वारा भी वित्त पोषित किया गया था , "Agencia Nacional de Investigación y DeSarrollo de Chile (ANID)" और MJFF-10332.01 (R.P.) और MJFF-17303 (F.C.) से माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन के लिए माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ANIMALS AND ANIMAL FOOD
Foxp3-GFP C57BL/6 mice The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) Stock No: 023800
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Wild-type C57BL/6 mice The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) Stock No: 000664
VIRAL VECTORS
AAV5-CBA-αSyn University of Iowa Viral Vector Core Facility N/A Stock concentration at 10E13 vg/mL
AAV5-CBA-eGFP University of Iowa Viral Vector Core Facility N/A Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL
ANESTHETICS AND ANALGESICS
Isoflurane Baxter 218082 1% for stereotaxic surgery
Ketamine Drag Pharma CHE30 70 mg/Kg  for stereotaxic surgery
Sevoflurane Baxter VE2L9117 For before transcardial perfusion
Tramadol Drag Pharma DPH134 30 mg/Kg every 24 h
Xylazine Centrovet EHL40 9 mg/kg for stereotaxic surgery
EQUIPMENT
Beam test Home made N/A horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2).
Cryostate Leica CM1520
Digital camera Nikon S2800 Coolpix For recording the beam test performance
Microscope Olympus BX51 Used for IHC analysis (section 4.4)
Microscope Olympus IX71 Used for IF analysis (section 5.3)
Microscope Leica DMI8 Used for IF analysis (section 5.7)
New Standard Stereotaxic, mouse Stoelting, Wood Dale, IL, USA 51500 stereotaxic frame for surgery
Peristaltic Pump Masterflex C-flex L/S16
Power supply unit Olympus U-RFL-T Used for IF analysis (section 5.3)
Surgical suture Sylkam®, B Braun C0760171
Syringe 100 U BD 324918 For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle
Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE Hamilton HA-7641-01 For viral vector innoculation
BUFFERS AND REAGENTS
Aviden, Peroxidase Conjugate Merck, Darmstadt, Germany 189728
Bovine Serum Albumin Merck, Darmstadt, Germany 9048-46-8
Cryotrotection buffer Home made N/A 20% glycerine and 2% DMSO in PBS
DAPI Abcam ab228549
Diaminobenzidine Merck, Darmstadt, Germany D8001
Fluoromount -G T Electron Microscopy Science 17984-25
Gelatin Merck, Darmstadt, Germany 104078
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Laboratory 5000121
Paraformaldehyde Merck, Darmstadt, Germany 104005
PBS Home made N/A 0.125 M, pH 7.4
Peroxidase inactivating buffer Home made N/A 0.03% H2O2 in methanol
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5
Trizma Hydrochloride Merck, Darmstadt, Germany 1185-53-1
Tween 20 Sigma-Aldrich 822184
ANTIBODIES
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratory 111065003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L)  Alexa Fluor 546 ThermoFisher Scientific A11010
Goat anti-Rabbit IgG (H+L)  Alexa Fluor 647 ThermoFisher Scientific A21244
Goat anti-Rat IgG (H+L)  Alexa Fluor 546 ThermoFisher Scientific A11081
Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein Abcam ab138501
Rabbit monoclonal anti-Iba-1 Abcam EPR16588
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase Millipore AB152
Rat monoclonal anti-CD4 Biolegend 100402
SOFTWARES
GraphPad Prism 6.0 Fos stats analysis
ImageJ National Institute of Health N/A For image analysis
LAS X Leica N/A For image capture with Leica microscope
ProgRes Capture Pro Jenoptik N/A For image capture with Olympus microscope
VLC media player VideoLAN Organization N/A For analysis of behavioural tests

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 185 पार्किंसंस रोग एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर α-सिन्यूक्लिन न्यूरोइन्फ्लेमेशन न्यूरोडीजेनेरेशन माउस मॉडल
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Elgueta, D., Chovar, O., Ugalde, V., Sánchez-Guajardo, V., Catenaccio, A., Court, F., Pacheco, R. Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human α-Synuclein. J. Vis. Exp. (185), e63313, doi:10.3791/63313 (2022).

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