Summary
Dette arbeidet analyserer vektordosen og eksponeringstiden som kreves for å indusere nevroinflammasjon, nevrodegenerasjon og motorisk svekkelse i denne prekliniske modellen av Parkinsons sykdom. Disse vektorene som koder den menneskelige α-synuclein leveres inn i substantia nigra for å rekapitulere synukleinpatologien forbundet med Parkinsons sykdom.
Abstract
Parkinsons sykdom er en nevrodegenerativ lidelse som involverer død av de dopaminerge nevronene i nigrostriatalbanen og følgelig det progressive tapet av kontroll over frivillige bevegelser. Denne nevrodegenerative prosessen utløses av avsetning av proteinaggregater i hjernen, som hovedsakelig består av α-synuklein. Flere studier har indikert at nevroinflammasjon er nødvendig for å utvikle nevrodegenerasjonen forbundet med Parkinsons sykdom. Spesielt innebærer nevroinflammatorisk prosess mikroglial aktivering samt infiltrasjon av perifere T-celler i substantia nigra (SN). Dette arbeidet analyserer en musemodell av Parkinsons sykdom som rekapitulerer mikroglial aktivering, T-celleinfiltrasjon i SN, nevrodegenerasjonen av nigral dopaminerge nevroner og motorisk svekkelse. Denne musemodellen av Parkinsons sykdom er indusert av stereotaxisk levering av adeno-assosierte virale vektorer som koder den menneskelige villtypen α-synuklein (AAV-hαSyn) inn i SN. Riktig levering av virale vektorer i SN ble bekreftet ved hjelp av kontrollvektorer som koder for grønt fluorescerende protein (GFP). Etterpå, hvordan dosen av AAV-hαSyn administrert i SN påvirket omfanget av hαSyn uttrykk, tap av nigral dopaminerge nevroner, og motorisk svekkelse ble evaluert. Videre ble dynamikken i hαSyn-uttrykk, mikroglial aktivering og T-celleinfiltrasjon bestemt gjennom hele tiden for sykdomsutvikling. Dermed gir denne studien kritiske tidspunkter som kan være nyttige for å målrette synukleinpatologi og nevroinflammasjon i denne prekliniske modellen av Parkinsons sykdom.
Introduction
Etter Alzheimers sykdom er Parkinsons sykdom den nest mest utbredte nevrodegenerative sykdommen over hele verden. De primære nevronene som er berørt i Parkinsons sykdom er de av nigrostriatalbanen, som produserer dopamin og kontrollerer frivillig bevegelse. Som en konsekvens er det mest karakteristiske symptomet forbundet med denne lidelsen motorisk svekkelse. Denne patologien innebærer også avsetning av proteinaggregater i hjernen, som hovedsakelig består av α-synuklein (αSyn)1, et cytosolisk protein forbundet med presynaptiske terminaler. Bevis har vist at genereringen av patogene inneslutninger av αSyn utløses ved feilfolding eller av noen post-translasjonelle modifikasjoner av detteproteinet 2.
Spesielt er det etablert et nært forhold mellom αSyn-patologi og tap av dopaminerge nevroner av nigrostriatalveien i menneskelig Parkinsons sykdom og dyremodeller 3,4. Å forstå hvordan αSyn-aggregater genereres og hvordan de induserer nevronal død representerer en betydelig utfordring i feltet. En voksende gruppe studier har vist at ved å øke oksidativt stress, er mitokondrie dysfunksjon en av de ledende årsakene til genereringen av αSyn aggregater2. Faktisk risikerer flere gener assosiert med Parkinsons sykdom å kode proteiner involvert i mitokondriefunksjon, morfologi og dynamikk 5,6. I tillegg utgjør lysosomal dysfunksjon, som resulterer i akkumulering av dysfunksjonelle mitokondrier og feilfoldede αSyn en annen stor begivenhet som fremmer genereringen av αSyn aggregater7.
Nye bevis har indikert at når αSyn-aggregater er deponert i hjernen, stimulerer disse patogene proteinene tolllignende reseptorer (TLRs) på mikroglia, og dermed utløser mikroglial aktivering og et innledende inflammatorisk miljø i substantia nigra (SN) 8,9. Videre indikerer bevisene at αSyn-aggregater fanges opp og presenteres av antigen-presenterende celler til T-celler, noe som induserer en adaptiv immunrespons som er spesifikk for αSyn10,11. Disse αSyn-spesifikke T-cellene infiltrerer deretter hjernen og er restimulert av aktivert mikroglia, og fremmer dermed sekresjonen av nevrotoksiske faktorer som fremkaller nevronal død 9,10. Interessant nok har flere bevislinjer antydet at αSyn-aggregater genereres først i det enteriske nervesystemet og deretter transporteres gjennom vagusnerven til hjernestammen12.
Flere dyremodeller av Parkinsons sykdom har blitt brukt i mange år, inkludert de som er indusert ved administrering av nevrotoksiske stoffer (dvs. 6-hydroksydopamin, paraquat, rotenone, 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin) og de som involverer genetiske tilstander (dvs. mutant α-synuclein, mutant leucinrik repetisjon kinase 2)13 . Til tross for modeller som involverer nevrotoksinindusert nevrodegenerasjon som replikerer noen aspekter av Parkinsons sykdom, rekapitulerer ingen av dem alle de essensielle aspektene av sykdommen eller er ikke progressive13. På den annen side, selv om genetiske musemodeller som involverer uttrykk for mutante versjoner av leucinrik gjentatt kinase 2, mutante versjoner av α-synuclein, eller overekspression av humane wild-type α-synuclein resulterer i motorisk svekkelse og, i noen tilfeller, også utviklingen av synucleinopati, de reproduserer ikke fremtredende nevrodegenerasjon av nigral dopaminerg nevroner, som er et viktig aspekt av Parkinsons sykdom13, 14. En tredje type dyremodell av nevrodegenerasjon har klart å møte de fleste av de essensielle aspektene ved Parkinsons sykdom, den stereotaktiske leveransen av adeno-assosierte virusvektorer (AAVs) som koder for den menneskelige α-synuclein (AAV-hαSyn)14,15. Det er viktig at AAVer tillater transduksjon av nevroner med høy effekt og på lang sikt i den voksne hjernen til pattedyr. Videre har den stereotaktiske leveransen av AAV-hαSyn i SN vist seg å reprodusere mange av de essensielle aspektene ved sykdommen, inkludert αSyn-patologi, mikroglial aktivering, nevrodegenerasjon og motorisk svekkelse 16,17,18,19,20. Denne studien presenterer en analyse av hvordan dosen av viral vektor og tiden etter viral vektor levering påvirker omfanget av hαSyn uttrykk, neurodegenerasjon, og neuroinflammation i nigrostriatal banen, samt graden av motorisk svekkelse i musen modell av ensidig stereotaxic levering av hαSyn i SN.
Protocol
Alle studiene ble utført under den 8. Eksperimentelle protokoller ble godkjent av IACUC ved Fundación Ciencia &Vida (Science for Life Foundation), inkludert de som involverer anestesi, smerte, nød og eutanasi (Tillatelsesnummer P-035/2022).
1. Stereotaxic kirurgi
- Forberedelse til operasjonen (ca. 1 time)
- For å opprettholde et aseptisk miljø, bruk passende kirurgiske klær under hele operasjonen, inkludert skodeksler, en kirurgisk maske, en sanitærbarriere, hansker og en kirurgisk hette.
- Spray 70% etanol på musen og alt kirurgisk materiale for å opprettholde et aseptisk miljø.
- For å indusere analgesi, injiser musen med carprofen 5 mg/kg subkutant (s.c.) hver 12 h21 starter 1 time før operasjonen og fortsetter til 3 dager etter operasjonen.
- For å bedøve musen, plasser dyret i et induksjonskammer. Åpne isofluranstrømmen med en hastighet på 0,5% og øk den deretter sakte opp til 5% over ca. 5 minutter til musen har mistet sin høyre refleks22.
- Fjern dyret fra induksjonskammeret. Overfør straks dyret til en ikke-rebreathing krets med en passende størrelse nese kjegle. Opprettholde musen anestesi med isofluran 1% gjennom hele operasjonstidspunktet.
- Bekreft at musen er helt bedøvet ved å klemme halen og potene. Når musen ikke reagerer på å klemme halen og potene, betyr det at musen er helt bedøvet.
- Barber musens hode med saks. Rengjør musens hud med en bomullspinne med klorhexidin 2% og fjern alt håret.
- Fest musens hode i den stereotaktiske rammen.
- Plasser en hornhinnebeskyttelse i begge museøyne ved hjelp av en bomullspinne. For å forhindre stressinduksjon hos andre gnagere, unngå tilstedeværelsen av noen annen mus i operasjonsrommet23.
- Operasjonen (ca. 30 min)
- Rengjør musens hode med tre runder med 2% klorhexidin etterfulgt av 70% etanol. Utsett skallen med kirurgisk materiale og lag et tynt hull med en bor ved følgende koordinater: anteroposterior −2,8 mm og middelmådig 1,4 mm med hensyn til mediallinjen.
- Sett nålen på en 10 μL sprøyte i hullet og flytt nålen sakte inn i hjernen til du ankommer −7,2 mm dorsoventral med hensyn til dura24.
- La nålen stå i den endelige posisjonen i 2 min for å la vevet slå seg litt ned, og injiser deretter 1 μL AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP), eller kjøretøy (PBS ved pH 7.4; sham kirurgi) i høyre substantia nigra med en hastighet på 0,2 μL/3.
- La nålen stå i samme posisjon i 5 minutter etter levering av virale vektorer og trekk den deretter sakte tilbake.
- Etter operasjonen (ca. 5 min)
- Lukk såret med en steril silkeflettet ikke-absorberbar sutur.
- Sett musen i hjemmeburet forvarsel ved å plassere den over en elektrisk oppvarmet (25 °C).
MERK: Musen må holdes alene i hjemmeburet til den er i stand til å gå uten problemer og såret har grodd.
2. Bestemmelse av motorytelse ved hjelp av stråletesten
- Opplæring (ca. 15 min per mus)
- Tolv uker etter den stereotaktiske operasjonen, vurder motorytelsen ved hjelp av en forenklet versjon av stråletesten beskrevet før25. Til dette formål, bruk en horisontal bjelke på 25 cm i lengde og 3 cm i bredde. Bjelkeoverflaten må dekkes med et metallisk rutenett med firkanter på 1 cm og forhøyet 1 cm over bjelken.
- Ta en video av musen som krysser rutenettets overflatestråle fra den ene enden til motsatt ende av bjelken, hvor hjemmeburet ligger. Tren musen i 2 dager før bestemmelse av motorytelse.
- På den første dagen, tren musen til å gå gjennom strålen fem ganger uten rutenettet.
- På den andre dagen, tren musen til å gå gjennom strålen i nærvær av rutenettet fem ganger.
- Testen (ca. 5 min per mus)
- På den tredje dagen evaluerer du motorytelsen. For å gjøre dette, kvantifisere antall feil utført av venstre poter eller av høyre poter separat ved å se videoene i sakte filmmodus.
MERK: En feil defineres som når en pote ikke tråkker riktig på rutenettet og derfor blir synlig på siden av rutenettet eller mellom rutenettet og bjelkeoverflaten.
- På den tredje dagen evaluerer du motorytelsen. For å gjøre dette, kvantifisere antall feil utført av venstre poter eller av høyre poter separat ved å se videoene i sakte filmmodus.
3. Vevsbehandling
- Transkardiale perfusjon (ca. 15 min per mus)
- For å bedøve musen, injiser en blanding av ketamin (80 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) intraperitonealt (dvs.) ved hjelp av en 1 ml sprøyte og 27 G nål26.
- Når musen er fullstendig bedøvet (bekreftet som i trinn 1.1.6.), åpner du thoraxen med kirurgisk materiale og eksponerer hjertet.
- Sett deretter en 21 G nål (gjør spissen flat ved hjelp av en bor) inn i hjertets venstre ventrikel.
- Ved å koble nålen til et rør, perfuse 50 ml PBS (pH 7,4) med en hastighet på 9,5 ml/min ved hjelp av en peristaltisk pumpe.
- Fikse og kryooprotecting hjernen (ca. 10 min per hjerne)
- Fjern hjernen ved hjelp av saks og pinsett, og fest den deretter ved nedsenking i 5 ml 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,4) ved 4 °C i 24 timer.
- Deretter legger du den faste hjernen i 15 ml 30% sukrose ved 4 °C i 48 timer.
- Sett deretter hjernen i 4 ml kryobeskyttelsesløsning (20% glyserin og 2% DMSO i PBS) og redd hjernen ved -80 °C eller bruk den umiddelbart i neste trinn.
- Oppnå hjerneskiver (ca. 20 min per hjerne).
MERK: Sørg for at hjernen er plassert i en kryostat i riktig posisjon for å lage koronalkutt.- For å oppnå SN-skiver, kutt hjernen i 40 μm tykke seksjoner som starter på −2,92 mm og etterbehandling ved −3,64 mm24.
- Høst hver skive i en brønn (som inneholder 1 ml kryobeskyttelsesløsning) av en 24-brønnsplate etter en anteroposterior rekkefølge som beskrevet før 25,27,28.
- For å utføre immunhiistokjemiske (avsnitt 4.) og immunfluorescensanalyser (avsnitt 5.) i SN, velg seks koronal SN-seksjoner tatt med ensartede intervaller (120 μm) som dekker hele rostrocaudalutbredelsen av kjernen (720 μm totalt), som beskrevet før 25,27,28.
- For å oppnå striatalskiver, kutt hjernen i 40 μm tykke seksjoner som starter på +1,34 mm og etterbehandling ved −0,26 mm24.
- Høst hver skive i en 2 ml kryotube (inneholder 1 ml kryobeskyttelsesløsning) etter en anteroposterior rekkefølge.
- For å utføre immunhiistokjemiske (avsnitt 4.) og immunfluorescensanalyser (avsnitt 5.) i striatum, velg fem koronar striatal seksjoner tatt med ensartede intervaller (320 μm) som dekker hele rostrocaudal utstrekning av kjernen (1600 μm totalt).
4. Immunhiistokjemisk analyse for å kvantifisere dopaminerge nevroner og mikrogliose (ca. 2 dager)
- For immunhiistokjemisk analyse av striatal eller nigral skiver, plasser settet med fem (striatum) eller seks (SN) skiver fra samme hjerne i en brønn av en 24-brønns plate.
- Vask seksjonene 3x med 1 ml PBS og inkuber deretter med 0,5 ml 0,03% H2O2 i metanol ved romtemperatur og med agitasjon i 30 min for å inaktivere endogen peroksidaseaktivitet.
- Vask seksjonene 3x med 1 ml PBS og inkuber med 0,5 ml blokkeringsløsning (4% geitserum, 0,05% Triton X-100 og 4% BSA i PBS) ved romtemperatur og med agitasjon i 40 minutter.
- Deretter inkuberes med 0,5 ml blokkeringsløsning som inneholder det primære antistoffet (kanin anti-tyrosinhydroksylase [TH] pAb fortynnet 1:1000 [se tabell 1]; eller kanin anti-Iba1 antistoff fortynnet 1:1000) ved romtemperatur og med agitasjon over natten.
- Vask seksjonene 3x med 1 ml PBS og inkuber med 0,5 ml blokkeringsløsning som inneholder biotinylert geit anti-kanin pAb (1:500, se tabell 1) ved romtemperatur og med agitasjon i 2 timer.
- Vask deretter seksjonene 3x med 1 ml PBS og inkuber med 0,5 ml peroksidasekonjugert avidin (1:5000, se tabell 1) i blokkeringsløsning ved romtemperatur og med agitasjon i 90 min.
- Vask seksjonene 3x med 1 ml PBS og inkuber med 0,5 ml substratoppløsning (0,05 % diaminobenzidin i 0,03 % H2O2/Trizma-HCl-buffer ved pH 7,6). Bruk hansker og en labjakke for dette trinnet, da diaminobenzidin er et potensielt kreftfremkallende middel.
- Når den spesifikke fargingen er tydelig (vanligvis 30 sek for TH og 5 min for Iba1), ta ut substratløsningen og vask seksjonene 3x med 1 ml PBS ved romtemperatur og med agitasjon. Utfør alltid immunisering av skiver av alle hjernene som er inkludert i samme eksperiment samtidig.
MERK: Den spesifikke fargingen av TH er tydelig når TH-immunostaining vises i SNs område, som viser en karakteristisk form i hjernen. Det spesifikke merket til Iba1 bestemmes når Iba1-immunostaining vises på kontrollhjerneskiver med typiske mikrogliale former, som bekreftes ved mikroskopobservasjon. På denne måten bestemmes den nøyaktige tiden for substratutstilling for IHC-analyse for hvert enkelt eksperiment. - Monter hjerneseksjonene på glasssklier ved hjelp av en løsning på 0,2% gelatin i 0,05 M Tris (pH 7,6). Plasser hvert sett med fem (striatum) eller seks (SN) skiver hentet fra samme hjerne i rostrocaudal rekkefølge på samme glasssklie.
- Kvantifisere antall TH+- nevroner i SN.
- For å kvantifisere TH+ nevroner i SN, anskaffe bilder av de seks skivene ved 20x forstørrelse ved hjelp av et lysfeltmikroskop, som beskrevet før 25,27,28. Bruk følgende fargejustering: fargetemperatur 3200 K, cyanrød 40 %, magentagrønn 39 %, gulblå 54 %, gamma 0,5, kontrast 37, lysstyrke 13, metning 5.
- Ved hjelp av Image J-programvaren velger du omkretsen av SN pars compacta på halvkule analysert. Unngå valg av TH+ nevroner fra det ventrale tegmentalområdet (VTA).
- Be deretter programvaren om å beregne det valgte området (vanligvis 0,04-0,07 mm2/halvkule, avhengig av rostrocaudal posisjon). Deretter koder du hver eneste TH+- nevron med en prikk ved hjelp av flerpunktsverktøyet.
- Bruk punktverktøyet til å be programvaren telle totalt antall prikker. Med antall totale prikker (TH + nevroner) og området av SNpc, beregne tettheten av TH + nevroner / mm2.
- Gjenta den samme beregningen på begge halvkule på de seks SN-skivene og beregn deretter gjennomsnittet av TH + nevroner / mm2 på ipsilaterale og kontralaterale sider.
- Kvantifisere antall aktiverte mikroglia i striatum
- For å kvantifisere aktivert mikroglia i striatum, få to bilder på hver halvkule for alle fem striatalskiver ved 20x forstørrelse ved hjelp av et lysfeltmikroskop og de samme innstillingene som er angitt i trinn 4.10.1. Ved hjelp av Image J-programvaren, i hvert enkelt bilde (viser et område på 660 μm x 877 μm), tagg med en prikk hver eneste celle som uttrykker høy Iba1-intensitet og ameboidform ved hjelp av multipunktverktøyet. Bruk punktverktøyet til å be programvaren telle totalt antall prikker.
- Med antall totale prikker og området på bildet, beregn tettheten av aktivert mikroglia (Iba1høye celler / mm2) som utført før29.
| Mål antigen | Koblet til | Klonalitet | Spesifikasjoner for vert | Specie reaktivitet* | Fortynning** |
| Tyrosin hydroksylase | N/a | Polyklonal | Kanin | Mus, Rotte, Menneskelig | 1/200 - 1/1000 |
| Iba1 | N/a | Monoklonale | Kanin | Mus, Rotte, Menneskelig | 1/1000 |
| alfa-Synuclein | N/a | Monoklonale | Kanin | Menneske | 1/150 |
| CD4 | N/a | Monoklonale | Rotte | Mus | 1/250 |
| IgG (H+L) | Biotinilert | Polyklonal | Geit | Kanin | 1/500 |
| IgG (H+L) | AlexaFluor 546 | Polyklonal | Geit | Kanin | 1/500 |
| IgG (H+L) | AlexaFluor 647 | Polyklonal | Geit | Kanin | 1/500 |
| IgG (H+L) | AlexaFluor 546 | Polyklonal | Geit | Rotte | 1/500 |
Tabell 1: Antistofffortynning. I/T, gjelder ikke. *, Det er bare spesifisert hvis det er reaktivitet med mus, rotte og menneske, uavhengig av reaktivitet med andre arter. **, En enkelt fortynning eller et fortynningsområde er angitt.
5. Immunfluorescensanalyse for å evaluere T-celleinfiltrasjon i nigrostriatalbanen (ca. 2 dager)
- For immunfluorescensanalyse av hαSyn eller TH/GFP på striatal- eller nigralskiver, sett sammen settet med fem (striatum) eller seks (SN) skiver fra samme hjerne i en brønn av en 24-brønns plate.
- Vask seksjonene 3x med 1 ml PBS og inkuber deretter med 0,5 ml blokkeringsløsning (0,3% Triton X-100, 0,05% tween20 og 5% BSA i PBS) ved romtemperatur og med agitasjon i 40 minutter.
- Deretter inkuberes med 0,5 ml blokkeringsløsning som inneholder det primære antistoffet (kanin anti-TH pAb fortynnet 1:500; eller kanin anti-hαSyn antistoff fortynnet 1:150, se tabell 1) ved romtemperatur og med agitasjon over natten.
- Vask seksjonene 3x med 1 ml PBS og inkuber med 0,5 ml blokkeringsløsning som inneholder AlexaFluor546-koblet anti-kanin sekundært antistoff (1:500, se tabell 1) og 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI; 1:1000) ved romtemperatur og med agitasjon i 2 h. Vask deretter seksjonene 3x med 1 ml PBS.
- Monter hjerneseksjonene på glasssklier som beskrevet ovenfor (trinn 4.9.). Bilder ble anskaffet med et invertert fluorescensmikroskop koblet til en strømforsyningsenhet.
- For immunfluorescensanalyse av TH/CD4/GFP(Foxp3) på niggerskiver, plasser settet med seks (SN) skiver fra samme hjerne i en brønn av en 24-brønns plate. Vask seksjonene 3x med 1 ml PBS og inkuber deretter med 0,5 ml blokkeringsløsning (0,5% Triton X-100, 0,5% fiskehudgelatin i PBS) ved romtemperatur og med agitasjon i 2 timer.
- Inkuber med 0,5 ml blokkeringsløsning som inneholder de primære antistoffene kanin anti-TH pAb (1:200, se tabell 1) og rotte anti-CD4 (1:250) ved 4 °C og med agitasjon over natten.
- Vask seksjonene 3x med 1 ml PBS og inkuber med 0,5 ml blokkeringsløsning som inneholder antikanin koblet til AlexaFluor 647 (1:500, se tabell 1) og antirotter koblet til AlexaFluor 546 (1:500) ved romtemperatur og med agitasjon i 2 timer. Vask deretter seksjonene 3x med 1 ml PBS.
- Sett hvert sett med seks (SN) skiver hentet fra samme hjerne i rostrocaudal rekkefølge på samme glasssklie og monter dem ved hjelp av Fluoromount G. Skaff bilder ved hjelp av et Leica DMi8 mikroskop. Bruk de konfiske mikroskopinnstillingene som er angitt i tabell 2 , til å hente bilder fra immunfluorescensanalyse.
| Chanel-navn | Terning | Bølgelengde for utslipp | Navn på oppslagstabell | Eksponeringstid | Vinne | Oppløsning XY | Oppløsning Z |
| Kanal 1 | Y5 | 700nm | Grå | 1 011,727 ms | høy brønnkapasitet | 2.237 um | 24.444 um |
| Kanal 2 | GFP | 525nm | Grønn | 326.851 ms | høy brønnkapasitet | 2.237 um | 24.444 um |
| Kanal 3 | TXR | 630nm | Rød | 406.344 ms | høy brønnkapasitet | 2.237 um | 24.444 um |
| Kanal 4 | Dapi | 460nm | Blå | 91.501 ms | høy brønnkapasitet | 2.237 um | 24.444 um |
Tabell 2: Kondokale mikroskopinnstillinger som brukes til anskaffelse av bilder fra immunfluorescensanalyse.
6. Statistisk analyse
- For å sammenligne data hentet fra de ipsilaterale og de kontralaterale sidene, bruk en paret to-tailed Student t-test.
- For å sammenligne data innhentet fra mus som mottar AAV-hαSyn og fra mus som mottar AAV-GFP eller sham-kirurgi, bruk en uparret to-tailed Student t-test. Vurder signifikante forskjeller når P-verdier < 0,05.
Representative Results
Validere riktig levering av AAV-vektorer i de dopaminerge nevronene i nigrostriatalbanen
For å studere prosessene for nevroinflammasjon, nevrodegenerasjon og motorisk svekkelse fremmet av synucleinpatologi, ble en musemodell av Parkinsons sykdom indusert av ensidig stereotaxisk levering av AAV-koding hαSyn i SN 16,17,30,31 brukt (se eksperimentell design i Supplerende figur 1 ). For å validere riktig levering av AAV-vektorer i de dopaminerge nevronene i nigrostriatalbanen, ble AAV-koding GFP (AAV-GFP) injisert i SN, og 12 uker senere ble GFP fluorescens og tyrosinhydroksylase (TH) immunoreaktivitet analysert i SN og striatum ved immunfluscoreence. Den GFP-assosierte fluorescensen ble observert utelukkende på den ipsilaterale siden, og det var betydelig kolokalisering med TH-immunoreaktivitet i både SN og striatum, noe som indikerer riktig levering av AAV-vektorer i de dopaminerge nevronene i nigrostriatalbanen (figur 1).
Figur 1: Analyse av levering av AAV-GFP i nigrostriatalbanen. Mus fikk AAV-GFP (1 x 1010 vg/mus) og 12 uker senere ble ofret, og TH ble immunostert i (A) SN (skalastenger er 118 μm) og (B) striatum (skalastenger er 100 μm). TH- og GFP-assosiert fluorescens ble analysert ved epifluorescensmikroskopi. Nuclei ble farget med DAPI. Representative bilder av sammenslåtte eller enkle flekker av TH (rød), GFP (grønn) og DAPI (blå) vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Sette opp dosen av viral vektor administrert for å indusere nevrodegenerasjon og motorisk svekkelse i musemodellen av Parkinsons sykdom indusert av AAV-hαSyn
For å teste dosen av AAV-hαSyn som kreves for å indusere en betydelig overekspresjon av hαSyn som fremmer nevrodegenerasjon av nigral dopaminerge nevroner, forskjellige doser (1 x 108 virale genomer [vg]/mus, 1 x 109 vg/mus, eller 1 x10 10 vg/mus) av AAV-hαSyn ble injisert, og 12 uker senere ble hαSyn immunoreaktivitet og omfanget av TH immunoreaktivitet evaluert i nigrostriatalveien. Selv om hαSyn-immunoreaktivitet var tydelig med alle doser testet i SN (figur 2), var det kun mus som fikk 1 x10 10 vg/mus som presenterte tydelig hαSyn-immunoreaktivitet i striatum (figur 3). Videre viste mus som fikk 1 x10 10 vg/mus av AAV-hαSyn et betydelig tap av dopaminerge nevroner i SN (figur 4A, B). Selv om mus som fikk 1 x10 10 vg/mus av AAV-GFP viste en lav grad (~20 %) av nevrosvikt (figur 4A,B), viste mus som fikk samme dose AAV-hαSyn en betydelig høyere grad av nevrodegenerasjon av ninal dopaminerge nevroner (figur 4C). Følgelig ble ytterligere eksperimenter utført ved hjelp av 1 x 1010 vg / mus av AAV-hαSyn. I tillegg ble omfanget av motorisk svekkelse bestemt hos mus som fikk forskjellige doser AAV-hαSyn ved hjelp av stråletesten (figur 5A), som beskrevet før25. En betydelig reduksjon i motorytelsen ble oppdaget utelukkende med 1 x10 10 vg/mus AAV-hαSyn i stråletesten både ved sammenligning av antall feil gjort av høyre og venstre pads (figur 5B) og ved sammenligning av totalt antall feil hos mus som mottar AAV-hαSyn sammenlignet med mus som mottar kontrollvektoren AAV-GFP (figur 5C). Følgelig ble ytterligere eksperimenter utført ved hjelp av 1 x 1010 vg / mus av AAV-hαSyn.
Figur 2: Analyse av humant α-synukleinuttrykk i SN av mus behandlet med forskjellige doser AAV-hαSyn. Mus fikk AAV-hαSyn ved (A) 1 x 1010 vg/mus, (B) 1 x 109 vg/mus, eller (C) 1 x 108 vg/mus og 12 uker senere ble ofret, og hαSyn-uttrykket ble analysert av immunfluorescence i SN ved hjelp av epifluorecensmikroskopi. Nuclei ble farget med DAPI. Representative bilder av sammenslåtte eller enkle flekker av hαSyn (rød) eller DAPI (blå) vises. Skalastenger er 118 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse av humant α-synukleinuttrykk i musenes striatum behandlet med ulike doser AAV-hαSyn. Mus fikk AAV-hαSyn ved (A) 1 x 1010 vg/mus, (B) 1 x 109 vg/mus, eller (C) 1 x 108 vg/mus) og 12 uker senere ble ofret, og hαSyn-uttrykket ble analysert av immunofluorescence i striatum ved hjelp av epifluscoreence mikroskopi. Nuclei ble farget med DAPI. Representative bilder av sammenslåtte eller enkle flekker av hαSyn (rød) eller DAPI (blå) vises. Skalastenger er 100 μm. Innsettingen øverst til høyre i de sammenslåtte bildene viser et interesseområde for høyere forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tap av dopaminerge nevroner av SN hos mus behandlet med forskjellige doser AAV-hαSyn eller kontrollvektor. Mus fikk AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mus, 1 x 109 vg/mus, eller 1 x 108 vg/mus) eller AAV-GFP (1 x 1010 vg/mus) og 12 uker senere ble ofret, og TH ble analysert i SNpc av immunohistokjemi. (A) Representative bilder. Skalastenger, 100 μm. (B,C) Tettheten av nevroner ble kvantifisert som antall TH + nevroner / mm2. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. n = 3–8 mus per gruppe. (B) En sammenligning av ipsilateral med kontralaterale sider ble utført ved hjelp av den to-tailed parvise Student t-test. (C) En sammenligning av ipsilaterale sider fra mus som fikk 1 x 1010 vg/mus av AAV-hαSyn eller AAV-GFP ble utført. (B,C) Mens hvite stenger indikerer kvantifiseringen av TH + nevroner på den ipsilaterale siden av mus som mottar AAV-hαSyn, indikerer grønne stenger kvantifiseringen av TH + nevroner på den ipsilaterale siden av mus som mottar AAV-GFP. Grå stenger indikerer kvantifiseringen av TH+ nevroner på den kontralaterale siden av den tilsvarende gruppen. Sammenligninger ble utført av en to-tailed uparret Student t-test. *p < 0,05; **p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av motorytelsen hos mus behandlet med ulike doser AAV-hαSyn. Mus fikk forskjellige doser (1 x 1010 vg/mus, 1 x 109 vg/mus eller 1 x 108 vg/mus) AAV-hαSyn eller AAV-GFP, og 12 uker senere ble motorytelsen evaluert av stråletesten. (A) Bilde av en mus som går på bjelken. (B) Antall feil utført av venstre lemmer (kontralaterale) versus høyre lemmer (ipsilateral) ble kvantifisert i gruppene av mus som mottar AAV-hαSyn. (C) Totalt antall feil ble sammenlignet mellom ulike eksperimentelle grupper som fikk samme dose AAV-hαSyn eller AAV-GFP. Data representerer gjennomsnitt ± SEM. n = 3–5 mus per gruppe. Sammenligninger ble utført av (B) en to-tailed Student t-test eller ved (C) en uparret to-tailed Student t-test. *p < 0,05; **p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Sette opp kinetikken til Parkinsons sykdomsmodell indusert av AAV-αSyn
Etter å ha bestemt riktig AAV-hαSyn-dose som brukes til å indusere et betydelig nivå av nevrodegenerasjon og motorisk svekkelse, ble eksperimenter for å definere utbruddet av hαSyn overekspression utført. Til dette formål ble mus behandlet med 1 x 1010 vg / mus av AAV-hαSyn eller sham kirurgi. Omfanget av hαSyn-uttrykket ble analysert i SN en gang i uken i uke 2-5 etter stereotoksisk kirurgi (se eksperimentell design i supplerende figur 2). Resultatene viser at til tross for at hαSyn-uttrykket ble oppdaget på lave nivåer så tidlig som 2 uker etter operasjonen, oppstod hαSyn-klynger i uke 5 etter den stereotaktiske operasjonen (figur 6).
Figur 6: Analyse av tidsforløpet for humant α-synukleinuttrykk i SN av mus behandlet med AAV-hαSyn. Mus fikk AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/mus) eller bare sham stereotaxic kirurgi, og uttrykket av hαSyn i SN ble analysert (A) 2 uker, (B) 3 uker, (C) 4 uker, eller (D) 5 uker senere ved immunfluorescence ved hjelp av epifluorescence mikroskopi. Nuclei ble farget med DAPI. Representative bilder av sammenslåtte eller enkle flekker av hαSyn (rød) eller DAPI (blå) vises. Skalastenger, 100 μm. Innsettingen øverst til høyre i de sammenslåtte bildene viser et interesseområde for høyere forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etterpå ble det utført eksperimenter for å bestemme passende tidspunkter for å analysere nevroinflammasjon og T-celleinfiltrasjon i sentralnervesystemet (CNS) etter stereotaxisk levering av AAV-hαSyn. For å bestemme toppen av mikroglial aktivering etter behandling av mus med AAV-hαSyn, ble omfanget av celler som uttrykker høye nivåer av Iba1 i striatum evaluert en gang i uken i uke 2-15 etter stereotoksisk kirurgi. Resultatene viser en betydelig økning i mikroglial aktivering av den ipsilaterale siden sammenlignet med den kontralaterale siden av mus 15 uker etter AAV-hαSyn-behandlingen (figur 7). Antallet Treg-celler (CD4+ Foxp3+) infiltrert i SNpc ble også evaluert på forskjellige tidspunkter etter stereotoksisk levering av AAV-hαSyn ved immunfluorescens etterfulgt av konfokal mikroskopiobservasjon. Resultatene viser at toppen av Treg infiltrasjon i SNpc var på 11 uker etter operasjonen, mens omfanget av Treg infiltrering dette området av hjernen var lavere i uke 8 eller uke 13 etter operasjonen (Figur 8). Det ble ikke oppdaget noen CD4+ T-celler som infiltrerte striatum (data ikke vist). Til sammen indikerer disse resultatene at ved hjelp av 1 x10 10 vg / mus av AAV-hαSyn, er det mest passende tidspunktet for å analysere nevroinflammasjon uke 15 etter stereotoksisk kirurgi, mens et riktig tidspunkt for å analysere T-celleinfiltrasjon i CNS ser ut til å være uke 11 etter AAV-hαSyn-behandling.
Figur 7: Analyse av tidsforløpet for mikroglial aktivering hos mus inokulert med AAV-hαSyn. Mus fikk AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mus), og mikroglial aktivering ble evaluert ved immunhiistokjemisk analyse av Iba1 i striatum på forskjellige tidspunkter etter operasjonen. (A) Representative oversiktsbilder av immunhiistokjemisk analyse av Iba1 fra mus ofret 5 uker, 10 uker eller 15 uker etter inokulasjon med AAV-hαSyn vises. Skalastenger, 110 μm. (B) Tettheten av aktivert mikroglia ble kvantifisert som antall celler som uttrykker høye nivåer av Iba1 og ameboidform per område. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. n = 3 mus per gruppe. En to-tailed parret Student t-test ble brukt til å bestemme statistiske forskjeller mellom ipsilateral og kontralateral Iba1 i hver gruppe. *p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Analyse av tidsforløpet for CD4+ T-celleinfiltrasjon i SN av mus inokulert med AAV-hαSyn. Foxp3gfp reporter mus mottok AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/ mus). Tilstedeværelsen av CD4+ T-celler som uttrykker Foxp3 og tilstedeværelsen av TH + nevroner ble analysert på forskjellige tidspunkter (uke 8, uke 11 og uke 13 etter operasjonen) i SN ved immunfluorescens. (A) Representative bilder for enkel immunstaining eller sammenslåing vises. Skalastenger, 100 μm. (B) Antall CD4+ Foxp3+ T-celler per område i SN ble kvantifisert. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM fra 3 mus per gruppe. *p<0.05, ipsilateral versus kontralateral CD4+ Foxp3+ T celler med to-tailed Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Eksperimentell design for evaluering av effekten av forskjellige doser av AAV-vektorer på synukleinpatologi, nevrodegenerasjon og motorisk svekkelse. Wild-type mannlige C57BL/6 mus ble bedøvet og fikk stereotoksisk inokulering av forskjellige doser (1 x 1010 vg/mus, 1 x 109 vg/mus, eller 1 x 108 vg/mus) AAV-koding av humant α-synuklein (AAV-hαSyn) eller eGFP (AAV-GFP) under kontroll av CBA-promotoren i høyre substantia nigra (SN). Etter 12 uker ble uttrykket av GFP og hαSyn i SN- og striatum (Str) evaluert av immunfluorescence (IF), tyrosinhydroksylasepositive (TH+) celler ble kvantifisert av immunhiokjemi (IHC) i SN, og motorisk ytelse ble evaluert av stråletesten. Antall mus i hver eksperimentell gruppe er angitt i parentes. * indikerer grupper der en mus døde før analysene. Hver analyse indikerer i parentes nummeret på figuren fra brødteksten i papiret der de tilsvarende resultatene vises. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Eksperimentell design for å bestemme kinetikken til T-celleinfiltrasjon, nevroinflammasjon og hαSyn-uttrykk. Foxp3gfp reporter mus ble bedøvet og fikk stereotaxisk inokulasjon av AAV (1 x 1010 vg / mus) koding menneskelig α-synuclein (AAV-hαSyn) under kontroll av CBA-promotoren i høyre substantia nigra (SN) eller sham kirurgi (PBS). Mus ble ofret på forskjellige tidspunkter, og uttrykket av hαSyn i SN- og striatum ble evaluert av immunfluorescence (IF), GFP (Foxp3), CD4 og tyrosinhydroksylasepositive (TH+) celler ble kvantifisert av IF i SN, og Iba1-uttrykket ble analysert av immunhiistokjemi (IHC) i striatum (Str). Antall mus i hver eksperimentell gruppe er indikert. Tidsintervallet som er inkludert i hver analyse, er angitt. Hver analyse indikerer i parentes nummeret på figuren fra brødteksten i papiret der de tilsvarende resultatene vises. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Musemodellen for nevrodegenerasjon analysert her kan bidra til å studere mange kritiske aspekter involvert i patofysiologien til Parkinsons sykdom, inkludert mekanismene som er involvert i αSyn-patologi og mikroglial aktivering, involvering av det perifere immunforsvaret i regulering av nevroinflammasjon og mekanismene for nevrodegenerasjon. Blant mekanismene som er involvert i αSyn-patologi er de subcellulære mekanismene forbundet med mitokondrie, lysosomal eller proteasomal dysfunksjon i nærvær av en overdreven belastning av αSyn i dopaminerge nevroner i SN2. Det er viktig å vurdere at, i tillegg til hαSyn-uttrykket indusert av AAV-mediert transduksjon, bidrar den endogene musen αSyn også til belastningen av totalt αSyn-uttrykk. Transgene mus over-uttrykkende mus αSyn utvikle lignende synuclein patologi, nevropatologi, og motorisk svekkelse til disse musemodellene basert på overekspression av hαSyn32. Når det gjelder mikroglial aktivering, kan den nåværende musemodellen brukes til å studere hvordan forskjellige molekylære og cellulære spillere som cytokiner, nevrotransmittere, astrocytter, nevroner, blod-hjernebarrieren og T-celler kan regulere oppkjøpet av proinflammatoriske eller antiinflammatoriske funksjonelle fenotyper 8,10,11 . Denne modellen utgjør også et viktig verktøy for å studere rollen til det perifere immunsystemet, inkludert ikke bare T-celler, men også makrofager, monocytter og nøytrofiler, på prosessene for nevroinflammasjon og nevrodegenerasjon av ninigrale nevroner 11,33,34. Til slutt representerer denne musemodellen også et verdifullt system for å studere de cellulære og molekylære mekanismene til nevrodegenerasjon in vivo, inkludert de som er indusert av interne cellulære prosesser, for eksempel oksidativt stress, energiunderskudd og skadede organeller 2, eller de som utøves av eksterne spillere, for eksempel nevrotoksiske faktorer produsert av mikrogliale celler, astrocytter og cytotoksiske T-celler8, 28,29,35.
En begrensning av denne musemodellen er studiet av hvordan den patologiske aggregeringen av αSyn på ekstra-cerebral steder kan utgjøre de første stadiene i utviklingen av Parkinsons sykdom36. I denne forbindelse er det voksende bevis som indikerer at αSyn-patologien begynner i tarmslimhinnen og det olfaktoriske epitelet36 før nevrodegenerasjonen og motorisk svekkelse, og sannsynligvis den αSyn-spesifikke T-celleresponsen samt12. Etterpå ville αSyn-aggregater migrere gjennom vagusnerven til hjernestammen, noe som utløste nevroinflammasjon og nevrodegenerasjon av dopaminerge nevroner12. Selv om AAV-hαSyn-modellen rekapitulerer de fleste aspekter av Parkinsons sykdom, er det ingen tydelig involvering av den patologiske aggregasjonen av αSyn på ekstra-cerebral steder i denne modellen. En alternativ modell som involverer hαSyn-patologi som er egnet for å studere disse aspektene av Parkinsons sykdom, kan være transgene mus som overekspresserer hαSyn under kontroll av Thy1-promotoren, Thy1-SNCA-modellen 37, der sykdomsutvikling er avhengig av tarmmikrobiota og innebærer en tydelig gastrointestinal svekkelse38.
Selv om det er nyttig for studiet av de forskjellige prosessene knyttet til patofysiologien til Parkinsons sykdom, innebærer den nåværende musemodellen kritiske trinn som bør kontrolleres i minuttet, inkludert riktig levering av virusvektorene i de tilsvarende romlige koordinatene, det selektive uttrykket av hαSyn i nevroner (som avhenger av AAV-serotypen og vektorkonstruksjonen), riktig AAV-dose og -timing før du analyserer parkinsonfenotypen. Analysen av riktig levering av virale vektorer i SN er nødvendig, da bruken av de riktige romlige koordinatene til SN kanskje ikke er nok når nålen ikke er helt rett, noe som noen ganger er umerkelig for det menneskelige øye. Videre avhenger diffusjonen av AAV-vektorene av AAV-serotypen39. Av disse grunnene er det nødvendig å utføre periodiske kvalitetskontroller som kontrollerer riktig levering og diffusjon av de injiserte AAV-GFP-vektorene etter observasjon av GFP i hjerneskiver som inneholder SNs område.
Når det gjelder det selektive uttrykket av hαSyn i nevroner, kan uttrykket av hαSyn i prinsippet konstrueres for å bli konstruert av en promotor som er selektiv for nevroner eller, enda mer presis, selektiv for dopaminerge nevroner, for eksempel bruk av TH-promotoren i AAV-vektorer for å indusere det selektive uttrykket av gener i dopaminerge nevroner40. . Denne strategien fungerer imidlertid ikke når det som søkes er overekspressering av genet av interesse. Av denne grunn er det i den nåværende modellen viktig å bruke en sterk promotor (en promotor som fremkaller høyt uttrykk for nedstrømsgenet) og AAV-serotyper med nevronal tropisme. I denne studien ble CBA-promotoren brukt som en sterk promotor for å indusere overekspressionen av hαSyn, og AAV5-serotypen ble brukt til virusvektoren. Denne serotypen har tidligere blitt brukt til å transdusere mus og rotte nevroner41,42. Her viste resultatene at 12 uker etter levering av AAV5-GFP i musenes SN var den grønne fluorescens selektivt til stede på den ipsilaterale siden av både SN og striatum (figur 1), noe som indikerer effektiv transduksjon av nevroner i nigrostriatalbanen.
Et annet kritisk aspekt ved denne musemodellen av Parkinsons sykdom er tidspunktet som kreves for å analysere en bestemt prosess etter operasjonen. I denne forbindelse viser dette arbeidet en kinetisk studie av ulike prosesser involvert i patologien. Siden viktige tidspunkter endres med dosen av virale genomer gitt per mus, ble serotypen av AAV brukt, eller til og med med batchen av AAV brukt, en doseresponsanalyse av mengden AAV-αSyn som kreves for å indusere et betydelig tap av TH + nevroner og motorisk svekkelse først utført. Tidligere studier har vist betydelig motorisk svekkelse og tap av TH + nevroner i nigrostriatalbanen etter 12 uker med AAV-αSyn-injeksjoner hos mus i doser fra 6 x 108-3 x10 10 virale genomer per mus 16,17,30,31. Følgelig varierte dosen av AAV-hαSyn for å indusere hαSyn-uttrykket i nigrostriatalbanen, tap av TH + nevroner og motorisk svekkelse hos mus fra 1 x 108-1 x10 10 virale genomer per mus. Videre, for å kontrollere at tapet av TH + nevroner og motorisk svekkelse ble indusert av overekspression av hαSyn i SN og ikke av AAV-infeksjon av nevroner i SN, ble kontrollgrupper inkludert der AAV-koding for et reportergen (AAV-eGFP) ble levert ensidig i SN av mus og nevrodegenerasjon og motorisk svekkelse ble bestemt. Resultatene viste at 1 x 1010 virale genomer per mus var en riktig dose AAV5-hαSyn, da mus som fikk denne virusbelastningen viste signifikant hαSyn i nigrostriatalbanen (figur 2 og figur 3), tap av TH+ nevroner (figur 4) og motorisk svekkelse (figur 5). Til sammenligning var lavere doser av AAV5-hαSyn (1 x 108 virale genomer per mus og 1 x 109 virale genomer per mus) ikke sterke nok til å nå betydelige endringer i alle disse parametrene sammen (figur 2-4). Vær oppmerksom på at administrasjonen av AAV-GFP ved 1 x10 10 virale genomer per mus induserte et lavt (~ 20%), men betydelig grad av tap av TH + nevroner av dopaminerge nevroner (figur 4A, B). Dette resultatet er enig med tidligere observasjoner ved hjelp av denne modellen41 og er sannsynligvis konsekvensen av et lavt nivå av nevroinflammasjon indusert av administrering av AAV-vektorer i SN. Likevel var omfanget av tap av TH + nevroner betydelig høyere hos mus som fikk AAV5-hαSyn sammenlignet med de som fikk samme dose AAV-GFP (figur 4C). Vær oppmerksom på at kinetikken til hαSyn-uttrykket ikke bare avhenger av effektiviteten av transduksjon, men også på omfanget av AAV-diffusjon39. Siden AAV-diffusjon avhenger av AAV-serotypen, kan de nøyaktige nøkkeltidspunktene i denne dyremodellen variere når du bruker en annen AAV-serotype som er forskjellig fra AAV5.
Etterpå ble det utført en kinetisk analyse ved hjelp av 1 x10 10 virale genomer per mus for å bestemme viktige tidspunkter i denne musemodellen. Siden dagens bevis har vist noen tidlige symptomer som oppstår før motorisk svekkelse, noe som ville tillate tidlig diagnose av Parkinsons sykdom43,44, forsøkte disse forsøkene å finne tidspunktet da hαSyn-uttrykket allerede var tydelig, men i fravær av motorisk svekkelse. Resultatene viser at utbruddet av hαSyn-uttrykket i SN var 5 uker etter den stereotaktiske leveransen av AAV-hαSyn (figur 6). Dette tidspunktet utgjør et interessant temporalt poeng for å begynne å administrere terapier skreddersydd for å stoppe nevroinflammatoriske og nevrodegenerative prosesser. Andre viktige tidspunkter som ble bestemt her var topptidene for to kritiske hendelser knyttet til nevroinflammasjonsprosessen: tiden da mikroglia når maksimal grad av aktivering og tidspunktet for maksimal T-celleinfiltrasjon i SN. Resultatene viste en kurve med en trend som nådde to bølger av maksimal mikroglial aktivering, den første på 10 uker etter operasjonen og den andre på 15 uker etter operasjonen (figur 7). Den kinetiske analysen av T-celleinfiltrasjon viste topptiden for Treg-infiltrasjon i SN 11 uker etter stereotoksisk kirurgi (figur 8). Overraskende nok ble det ikke oppdaget noen effektor T-celler (CD4+ Foxp3-) som infiltrerte SN i løpet av tidsrammen analysert (uke 8-13 etter operasjonen). Til sammen antyder disse resultatene en riktig tidsramme for å begynne å administrere terapier rettet mot å stoppe prosessen med nevroinflammasjon og demping av T-celleinfiltrasjon i SN ved hjelp av denne prekliniske modellen, som varierer mellom uke 5 etter operasjonen (utbruddet av hαSyn overekspressjon) og uke 10 etter operasjonen (den første bølgen av nevroflainmmasjon og T-celleinfiltrasjon) (figur 9).
Figur 9: Sammendrag av de viktigste tidspunktene som finnes for denne dyremodellen.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av økonomiske eller ikke-finansielle konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Sebastián Valenzuela og Dr. Micaela Ricca for deres verdifulle veterinærhjelp i dyreavdelingen vår. Dette arbeidet ble støttet av "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia &Vida, FB210008 (til Fundación Ciencia &Vida), og Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Dette arbeidet ble også finansiert av tilskudd FONDECYT-1210013 (til R.P.) og FONDECYT-1150766 (til F.C.) fra "Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)" og MJFF-10332.01 (til R.P.) og MJFF-17303 (til FC) fra Michael J Fox Foundation for Parkinsons forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS AND ANIMAL FOOD | |||
| Foxp3-GFP C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 023800 | |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Wild-type C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 000664 | |
| VIRAL VECTORS | |||
| AAV5-CBA-αSyn | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 10E13 vg/mL |
| AAV5-CBA-eGFP | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL |
| ANESTHETICS AND ANALGESICS | |||
| Isoflurane | Baxter | 218082 | 1% for stereotaxic surgery |
| Ketamine | Drag Pharma | CHE30 | 70 mg/Kg for stereotaxic surgery |
| Sevoflurane | Baxter | VE2L9117 | For before transcardial perfusion |
| Tramadol | Drag Pharma | DPH134 | 30 mg/Kg every 24 h |
| Xylazine | Centrovet | EHL40 | 9 mg/kg for stereotaxic surgery |
| EQUIPMENT | |||
| Beam test | Home made | N/A | horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2). |
| Cryostate | Leica | CM1520 | |
| Digital camera | Nikon | S2800 Coolpix | For recording the beam test performance |
| Microscope | Olympus | BX51 | Used for IHC analysis (section 4.4) |
| Microscope | Olympus | IX71 | Used for IF analysis (section 5.3) |
| Microscope | Leica | DMI8 | Used for IF analysis (section 5.7) |
| New Standard Stereotaxic, mouse | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51500 | stereotaxic frame for surgery |
| Peristaltic Pump | Masterflex | C-flex L/S16 | |
| Power supply unit | Olympus | U-RFL-T | Used for IF analysis (section 5.3) |
| Surgical suture | Sylkam®, B Braun | C0760171 | |
| Syringe 100 U | BD | 324918 | For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle |
| Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | HA-7641-01 | For viral vector innoculation |
| BUFFERS AND REAGENTS | |||
| Aviden, Peroxidase Conjugate | Merck, Darmstadt, Germany | 189728 | |
| Bovine Serum Albumin | Merck, Darmstadt, Germany | 9048-46-8 | |
| Cryotrotection buffer | Home made | N/A | 20% glycerine and 2% DMSO in PBS |
| DAPI | Abcam | ab228549 | |
| Diaminobenzidine | Merck, Darmstadt, Germany | D8001 | |
| Fluoromount -G T | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Gelatin | Merck, Darmstadt, Germany | 104078 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 5000121 | |
| Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 104005 | |
| PBS | Home made | N/A | 0.125 M, pH 7.4 |
| Peroxidase inactivating buffer | Home made | N/A | 0.03% H2O2 in methanol |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| Trizma Hydrochloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1185-53-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 822184 | |
| ANTIBODIES | |||
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 111065003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11010 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A21244 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11081 | |
| Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein | Abcam | ab138501 | |
| Rabbit monoclonal anti-Iba-1 | Abcam | EPR16588 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | |
| Rat monoclonal anti-CD4 | Biolegend | 100402 | |
| SOFTWARES | |||
| GraphPad | Prism | 6.0 | Fos stats analysis |
| ImageJ | National Institute of Health | N/A | For image analysis |
| LAS X | Leica | N/A | For image capture with Leica microscope |
| ProgRes Capture Pro | Jenoptik | N/A | For image capture with Olympus microscope |
| VLC media player | VideoLAN Organization | N/A | For analysis of behavioural tests |
References
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Lim, K. L., Zhang, C. W. Molecular events underlying Parkinson's disease - An interwoven tapestry. Frontiers in Neurology. 4, 33 (2013).
- Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
- Mori, F., et al. Relationship among alpha-synuclein accumulation, dopamine synthesis, and neurodegeneration in Parkinson disease substantia nigra. The Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 65 (8), 808-815 (2006).
- Winklhofer, K. F., Haass, C.
- Vazquez-Velez, G. E., Zoghbi, H. Y. Parkinson's disease genetics and pathophysiology. Annual Review of Neuroscience. 44, 87-108 (2021).
- Dehay, B., et al.
- Gonzalez, H., Elgueta, D., Montoya, A., Pacheco, R. Neuroimmune regulation of microglial activity involved in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. Journal of Neuroimmunology. 274 (1-2), 1-13 (2014).
- Pacheco, R. T-cell based immunotherapies for Parkinson's disease. Exploration of Neuroprotective Therapy. 1 (2), 72-85 (2021).
- Gonzalez, H., Contreras, F., Pacheco, R. Regulation of the neurodegenerative process associated to Parkinson's disease by CD4+ T-cells. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 10 (4), 561-575 (2015).
- Gonzalez, H., Pacheco, R. T-cell-mediated regulation of neuroinflammation involved in neurodegenerative diseases. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 201 (2014).
- Campos-Acuna, J., Elgueta, D., Pacheco, R. T-cell-driven inflammation as a mediator of the gut-brain axis involved in Parkinson's disease. Frontiers in Immunology. 10, 239 (2019).
- Blesa, J., Phani, S., Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Classic and new animal models of Parkinson's disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 845618 (2012).
- Ulusoy, A., Decressac, M., Kirik, D., Bjorklund, A. Viral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein as a progressive model of Parkinson's disease. Progress in Brain Research. 184, 89-111 (2010).
- Gomez-Benito, M., et al. Modeling Parkinson's disease with the alpha-synuclein protein. Frontiers in Pharmacology. 11, 356 (2020).
- Song, L. K., et al. Targeted overexpression of alpha-synuclein by rAAV2/1 vectors induces progressive nigrostriatal degeneration and increases vulnerability to MPTP in mouse. PLoS One. 10 (6), 0131281 (2015).
- Theodore, S., Cao, S., McLean, P. J., Standaert, D. G. Targeted overexpression of human alpha-synuclein triggers microglial activation and an adaptive immune response in a mouse model of Parkinson disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 67 (12), 1149-1158 (2008).
- Sanchez-Guajardo, V., Annibali, A., Jensen, P. H., Romero-Ramos, M. alpha-Synuclein vaccination prevents the accumulation of parkinson disease-like pathologic inclusions in striatum in association with regulatory T cell recruitment in a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 72 (7), 624-645 (2013).
- Sanchez-Guajardo, V., Febbraro, F., Kirik, D., Romero-Ramos, M. Microglia acquire distinct activation profiles depending on the degree of alpha-synuclein neuropathology in a rAAV based model of Parkinson's disease. PLoS One. 5 (1), 8784 (2010).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 8, 44 (2013).
- Cho, C., et al. Evaluating analgesic efficacy and administration route following craniotomy in mice using the grimace scale. Scientific Reports. 9 (1), 359 (2019).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. 3rd Ed. , ElsevierAcademic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Bind, R. H., Minney, S. M., Rosenfeld, S., Hallock, R. M. The role of pheromonal responses in rodent behavior: Future directions for the development of laboratory protocols. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (2), 124-129 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Cambridge, MA. (2001).
- Elgueta, D., et al. Dopamine receptor D3 expression is altered in CD4+ T-cells from Parkinson's disease patients and its pharmacologic inhibition attenuates the motor impairment in a mouse model. Frontiers in Immunology. 10, 981 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Fernandez-Suarez, D., et al. The monoacylglycerol lipase inhibitor JZL184 is neuroprotective and alters glial cell phenotype in the chronic MPTP mouse model. Neurobiology of Aging. 35 (11), 2603-2616 (2014).
- Elgueta, D., et al. Pharmacologic antagonism of dopamine receptor D3 attenuates neurodegeneration and motor impairment in a mouse model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 113, 110-123 (2017).
- Montoya, A., et al. Dopamine receptor D3 signalling in astrocytes promotes neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 258 (2019).
- Williams, G. P., et al. Targeting of the class II transactivator attenuates inflammation and neurodegeneration in an alpha-synuclein model of Parkinson's disease. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 244 (2018).
- Benskey, M. J., et al. Silencing alpha synuclein in mature nigral neurons results in rapid neuroinflammation and subsequent toxicity. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 36 (2018).
- Rieker, C., et al. Neuropathology in mice expressing mouse alpha-synuclein. PLoS One. 6 (9), 24834 (2011).
- Harms, A. S., et al. alpha-Synuclein fibrils recruit peripheral immune cells in the rat brain prior to neurodegeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 85 (2017).
- Williams, G. P., et al. CD4 T cells mediate brain inflammation and neurodegeneration in a mouse model of Parkinson disease. Brain. 144 (7), 2047-2059 (2021).
- Matheoud, D., et al. Intestinal infection triggers Parkinson's disease-like symptoms in Pink1(-/-) mice. Nature. 571 (7766), 565-569 (2019).
- Jan, A., Goncalves, N. P., Vaegter, C. B., Jensen, P. H., Ferreira, N. The prion-like spreading of alpha-synuclein in Parkinson's disease: Update on models and hypotheses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 8338 (2021).
- Chesselet, M. F., et al. A progressive mouse model of Parkinson's disease: The Thy1-aSyn ("Line 61") mice. Neurotherapeutics. 9 (2), 297-314 (2012).
- Sampson, T. R., et al. Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson's disease. Cell. 167 (6), 1469-1480 (2016).
- Ciron, C., et al. Human alpha-iduronidase gene transfer mediated by adeno-associated virus types 1, 2, and 5 in the brain of nonhuman primates: Vector diffusion and biodistribution. Human Gene Therapy. 20 (4), 350-360 (2009).
- Ben-Shaanan, T. L., et al. Activation of the reward system boosts innate and adaptive immunity. Nature Medicine. 22 (8), 940-944 (2016).
- Albert, K., Voutilainen, M. H., Domanskyi, A., Airavaara, M. AAV vector-mediated gene delivery to substantia nigra dopamine neurons: Implications for gene therapy and disease models. Genes. 8 (2), 63 (2017).
- Bordia, T., Perez, X. A., Heiss, J., Zhang, D., Quik, M. Optogenetic activation of striatal cholinergic interneurons regulates L-dopa-induced dyskinesias. Neurobiology of Disease. 91, 47-58 (2016).
- Kim, A., et al. Upgraded methodology for the development of early diagnosis of Parkinson's disease based on searching blood markers in patients and experimental models. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3437-3450 (2018).
- Lei, H., et al. Parkinson's disease diagnosis via joint learning from multiple modalities and relations. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 23 (4), 1437-1449 (2018).
