Quantificação de espécies reativas de oxigênio usando 2′,7′-Sonda diacetato de diclorofluoresceína e flução-citometria em células gliais Müller
Summary
Aqui, propomos um protocolo sistematizado, acessível e reprodutível para detectar espécies de oxigênio reativa celular (ROS) usando uma sonda diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) em células gliais Müller (MGCs). Este método quantifica os níveis ros celulares totais com um citómetro de fluxo. Este protocolo é muito fácil de usar, adequado e reprodutível.
Abstract
O balanço redox tem um papel importante na manutenção da homeostase celular. O aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) promove a modificação de proteínas, lipídios e DNA, o que finalmente pode levar a alterações na função celular e morte celular. Portanto, é benéfico para as células aumentar sua defesa antioxidante em resposta a insultos prejudiciais, seja ativando uma via antioxidante como Keap1/Nrf2 ou melhorando os catadores de redox (vitaminas A, C e E, β-caroteno, e polifenóis, entre outros). Inflamação e estresse oxidativo estão envolvidos na patogênese e progressão de retinopatias, como retinopatia diabética (DR) e retinopatia da prematuridade (ROP). Uma vez que as células gliais Müller (MGCs) desempenham um papel fundamental na homeostase do tecido neural da retina, elas são consideradas um modelo ideal para estudar esses mecanismos de proteção celular. Nesse sentido, quantificar os níveis ros com um método reprodutível e simples é essencial para avaliar a contribuição de caminhos ou moléculas que participam do mecanismo de defesa celular antioxidante. Neste artigo, fornecemos uma descrição completa dos procedimentos necessários para a medição do ROS com sonda DCFH-DA e citometria de fluxo em MGCs. Etapas-chave para o processamento de dados de citometria de fluxo com o software são fornecidas aqui, para que os leitores possam medir os níveis DE ROS (meios geométricos do FITC) e analisar histogramas de fluorescência. Essas ferramentas são altamente úteis para avaliar não apenas o aumento do ROS após um insulto celular, mas também para estudar o efeito antioxidante de certas moléculas que podem fornecer um efeito protetor sobre as células.
Introduction
A retina neural é um tecido muito organizado que apresenta camadas neuronais bem definidas. Nestes, os neurônios (gânglios, amacrinas, bipolares, horizontais e fotorreceptoras) estão interligados entre si e também com células gliais Müller (MGCs) e astrócitos, levando à fototransdução e processamento adequados de informações visuais 1,2. Os MGCs são conhecidos por terem um papel importante na manutenção da homeostase da retina porque atravessam toda a seção da retina e, assim, podem interagir com todos os tipos celulares que modulam múltiplos processos de proteção. Foi relatado que as MGCs possuem diversas funções importantes para a manutenção e sobrevivência dos neurônios da retina, incluindo a glicólise para fornecer energia aos neurônios, a remoção de resíduos neuronais, a reciclagem de neurotransmissores e a liberação de fatores neurotróficos, entre outros 3,4,5.
Por outro lado, inflamação, estresse oxidativo e nitrosativo estão envolvidos na patogênese e progressão de muitas doenças humanas, incluindo retinopatias 6,7,8,9,10,11. O equilíbrio redox nas células depende de uma regulação rigorosa dos níveis de ROS. As ROS são constantemente geradas em condições fisiológicas como resultado da respiração aeróbica principalmente. Os principais membros da família ROS incluem radicais livres reativos, como o ânion superóxido (O2009•−), radicais hidroxílicos (•OH), vários peróxidos (ROOR′), hidroperóxidos (ROOH) e o peróxido de hidrogênio não radical (H2O2)12,13. Nos últimos anos, tornou-se evidente que a ROS desempenha um importante papel de sinalização nas células, controlando processos essenciais. Os MGCs possuem forte defesa antioxidante pela ativação do fator nuclear transcricional fator 2 (Nrf2) e pela subsequente expressão de proteínas antioxidantes para eliminar a produção excessiva de ROS sob condições patológicas 14,15,16. Quando as células perdem o equilíbrio de redox devido a uma produção exagerada de ROS ou uma capacidade defeituosa de remover ROS, o acúmulo de estresse oxidativo promove modificações nocivas em proteínas, lipídios e DNA, levando ao estresse celular ou à morte. O aumento do sistema de defesa antioxidante da retina melhora a resolução e prevenção de retinopatias, como ROP e RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Portanto, a medição da produção de ROS em tempo real é uma ferramenta poderosa e útil.
Existem vários métodos para medir a produção de ROS ou estresse oxidativo nas células. Entre elas, a sonda diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) é uma das técnicas mais utilizadas para quantificar diretamente o estado de redox de uma célula 25,26,27,28. Esta sonda é lipofílica e não fluorescente. A difusão desta sonda através da membrana celular permite seu decote por esterases intracelulares nas duas ligações éster, produzindo um produto relativamente polar e de membrana celular impermeável, 2′,7′-diclororesceína (H2DCF). Esta molécula não fluorescente acumula-se intracelularmente, e a oxidação subsequente pela ROS produz o produto altamente fluorescente DCF. A oxidação da sonda é o produto da ação de múltiplos tipos de ROS (peroxito, radicais hidroxil, óxido nítrico ou peróxido), que pode ser detectada por citometria de fluxo ou microscopia concórdia (emissão a 530 nm e excitação a 485 nm). A limitação desta técnica é que o superóxido e o peróxido de hidrogênio não reagem fortemente com H2DCF25,29. Neste artigo, usamos a sonda DCFH-DA para medir e quantificar a ROS por citometria de fluxo. Por essa razão, induzimos a produção de ROS estimulando MGCs com indutor ROS, A ou B, antes de carregar as células com a sonda fluorescente. Além disso, usamos um composto antioxidante. Finalmente, mostramos dados representativos e confiáveis obtidos usando este protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Várias condições patológicas, como câncer, doenças inflamatórias, isquemia/reperfusão, doença isquêmica do coração, diabetes e retinopatias, e também situações fisiológicas como o envelhecimento, levam à superprodução ROS 6,7,8,9,10,11. Portanto, a detecção, a medição e a compreensão do caminho envolvi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a María Pilar Crespo e Paula Alejandra Abadie do CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) pela assistência na citometria de fluxo e Gabriela Furlan e Noelia Maldonado pela assistência à cultura celular. Agradecemos também a Victor Diaz (Pró-Secretário de Comunicação Institucional da FCQ) pela produção e edição de vídeo.
Este artigo foi financiado por subvenções da Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) e Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (todos para M.C.S.).
Materials
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S – Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon – Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
Riferimenti
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