Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

Summary

Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.

Abstract

Das Redoxgleichgewicht spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Die erhöhte Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) fördert die Modifikation von Proteinen, Lipiden und DNA, was schließlich zu einer Veränderung der Zellfunktion und des Zelltods führen kann. Daher ist es für die Zellen von Vorteil, ihre antioxidative Abwehr als Reaktion auf schädliche Beleidigungen zu erhöhen, entweder durch Aktivierung eines antioxidativen Weges wie Keap1 / Nrf2 oder durch Verbesserung der Redoxfänger (Vitamine A, C und E, β-Carotin und Polyphenole, unter anderem). Entzündungen und oxidativer Stress sind an der Pathogenese und dem Fortschreiten von Retinopathien wie der diabetischen Retinopathie (DR) und der Frühgeborenen-Retinopathie (ROP) beteiligt. Da Müller-Gliazellen (MGCs) eine Schlüsselrolle bei der Homöostase von neuronalem Netzhautgewebe spielen, gelten sie als ideales Modell, um diese zellulären Schutzmechanismen zu untersuchen. In diesem Sinne ist die Quantifizierung der ROS-Spiegel mit einer reproduzierbaren und einfachen Methode unerlässlich, um den Beitrag von Signalwegen oder Molekülen zu beurteilen, die am antioxidativen Zellabwehrmechanismus beteiligt sind. In diesem Artikel geben wir eine vollständige Beschreibung der Verfahren, die für die Messung von ROS mit DCFH-DA-Sonde und Durchflusszytometrie in MGCs erforderlich sind. Wichtige Schritte für die Datenverarbeitung der Durchflusszytometrie mit der Software werden hier bereitgestellt, so dass die Leser in der Lage sein werden, ROS-Werte (geometrische Mittel von FITC) zu messen und Fluoreszenzhistogramme zu analysieren. Diese Werkzeuge sind sehr hilfreich, um nicht nur den Anstieg des ROS nach einer zellulären Beleidigung zu bewerten, sondern auch die antioxidative Wirkung bestimmter Moleküle zu untersuchen, die eine schützende Wirkung auf die Zellen haben können.

Introduction

Die neuronale Netzhaut ist ein sehr organisiertes Gewebe, das gut definierte neuronale Schichten aufweist. In diesen sind Neuronen (Ganglien-, Amakrin-, bipolare, horizontale und Photorezeptorzellen) miteinander und auch mit Müller-Gliazellen (MGCs) und Astrozyten verbunden, was zu einer adäquaten Phototransduktion und Verarbeitung visueller Informationen^{führt 1,2}. Es ist bekannt, dass MGCs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der retinalen Homöostase spielen, da sie den gesamten Netzhautabschnitt durchqueren und somit mit allen Zelltypen interagieren können, die mehrere Schutzprozesse modulieren. Es wurde berichtet, dass MGCs mehrere wichtige Funktionen für die Erhaltung und das Überleben von retinalen Neuronen haben, einschließlich Glykolyse zur Energieversorgung von Neuronen, die Entfernung von neuronalen Abfällen, das Recycling von Neurotransmittern und die Freisetzung neurotropher Faktoren, unter anderem ^3,4,5.

Auf der anderen Seite sind Entzündungen, oxidativer und nitrosativer Stress an der Pathogenese und dem Fortschreiten vieler menschlicher Krankheiten beteiligt, einschließlich der Retinopathien 6,7,8,9,10,11. Das Redoxgleichgewicht in den Zellen hängt von einer strengen Regulierung der ROS-Werte ab. ROS werden ständig unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich durch aerobe Atmung erzeugt. Zu den Hauptmitgliedern der ROS-Familie gehören reaktive freie Radikale wie das Superoxid-Anion (O_2͘͘͘͘^•−), Hydroxylradikale (•OH), verschiedene Peroxide (ROOR′), Hydroperoxide (^ROOH) und das radikalfreie Wasserstoffperoxid (_H2O2)^12,13. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass ROS eine wichtige Signalisierungsrolle in den Zellen spielt, indem es essentielle Prozesse steuert. MGCs haben eine starke antioxidative Abwehr durch die Aktivierung des transkriptionellen Kernfaktors Erythroid-2-verwandter Faktor 2 (Nrf2) und die anschließende Expression von antioxidativen Proteinen, um die übermäßige Produktion von ROS unter pathologischen Bedingungen^{zu beseitigen 14,15,16}. Wenn die Zellen ihr Redoxgleichgewicht aufgrund einer übertriebenen Produktion von ROS oder einer mangelhaften Fähigkeit, ROS zu entfernen, verlieren, fördert die Anhäufung von oxidativem Stress schädliche Veränderungen in Proteinen, Lipiden und DNA, was zu zellulärem Stress oder Tod führt. Die Erhöhung des retinalen antioxidativen Abwehrsystems verbessert die Auflösung und Vorbeugung von Retinopathien wie ROP und RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Daher ist die Messung der ROS-Produktion in Echtzeit ein leistungsfähiges und nützliches Werkzeug.

Es gibt mehrere Methoden, um die ROS-Produktion oder den oxidativen Stress in Zellen zu messen. Unter diesen ist die 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetat (DCFH-DA)-Sonde eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur direkten Quantifizierung des Redoxzustands einer Zelle^25,26,27,28. Diese Sonde ist lipophil und nicht fluoreszierend. Die Diffusion dieser Sonde über die Zellmembran ermöglicht ihre Spaltung durch intrazelluläre Esterasen an den beiden Esterbindungen, wodurch ein relativ polares und zellmembranundurchlässiges Produkt, 2′,7′-Dichlorfluorescein (H2 DCF), entsteht_. Dieses nicht-fluoreszierende Molekül reichert sich intrazellulär an, und die anschließende Oxidation durch ROS ergibt das hochfluoreszierende Produkt DCF. Die Oxidation der Sonde ist das Produkt der Wirkung mehrerer Arten von ROS (Peroxynitrit, Hydroxylradikale, Stickstoffmonoxid oder Peroxide), die durch Durchflusszytometrie oder konfokale Mikroskopie (Emission bei 530 nm und Anregung bei 485 nm) nachgewiesen werden können. Die Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass Superoxid und Wasserstoffperoxid nicht stark mit_H2DCF^25,29 reagieren. In diesem Artikel verwenden wir die DCFH-DA-Sonde, um ROS durch Durchflusszytometrie zu messen und zu quantifizieren. Aus diesem Grund induzieren wir die ROS-Produktion, indem wir MGCs mit ROS-Induktor, A oder B, stimulieren, bevor wir die Zellen mit der Fluoreszenzsonde beladen. Darüber hinaus verwenden wir eine antioxidative Verbindung. Schließlich zeigen wir repräsentative und zuverlässige Daten, die mit diesem Protokoll erhalten wurden.

Protocol

HINWEIS: Informationen zu Pufferzusammensetzungen finden Sie in Tabelle 1. 1. Zellkulturvorbereitung HINWEIS: Beschrieben wird hier die Kulturvorbereitung von MIO-M1-Zellen, einer spontan immortalisierten menschlichen Müller-Gliazelllinie (Moorfield’s/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Verwenden Sie immer die richtige aseptische Technik und arbeiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube. Bereiten Sie Dulbeccos modifizierte…

Representative Results

Wie im Protokollabschnitt beschrieben, haben wir repräsentative und quantitative Daten gezeigt, die die Durchflusszytometrie-Detektion der ROS-Produktion mit der Fluoreszenzsonde DCFH-DA aus MIO-M1-Zellen demonstrieren, die mit ROS-Induktor, A oder B stimuliert wurden. Wie erwartet, beobachteten wir Veränderungen der FITC-Fluoreszenz in unstimulierten Zellen oberhalb der Autofluoreszenzspiegel (Abbildung 1A, vergleichen Sie “Basalkontrolle” vs. “Autofluoreszenzkontrolle”, Punktdiagrammdiag…

Discussion

Mehrere pathologische Zustände wie Krebs, entzündliche Erkrankungen, Ischämie / Reperfusion, ischämische Herzerkrankungen, Diabetes und Retinopathien sowie physiologische Situationen wie das Altern führen zu einer ROS-Überproduktion 6,7,8,9,10,11. Daher sind der Nachweis, die Messung und das Verständnis des Signalwegs,…

Materials

2′,7′-DCFH-DA	Sigma	35845-1G
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco by life technologies	15630-080
BD FACSCanto II flow cytometer	BD Biosciences	FACSCanto
BD FACSDiva software	BD Biosciences
Cell Culture Dishes 100×20 mm	Cell Star- Greiner Bio-One	664 160
Centrifuge	Thermo	Sorvall legend micro 17 R
Centrifuge Tubes (15 ml)	BIOFIL	CFT011150
Centrifuge Tubes (50 ml)	BIOFIL	CFT011500
Cryovial	CRYO.S – Greiner Bio-One	126263
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387520-1KG
Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate	Merck	106575
DMEM without phenol red	Gibco by life technologies	31053-028
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco by life technologies	11995065
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate	Merck	324503
Fetal Bovine Serum	Internegocios
FlowJo v10 Software	BD Biosciences
Glucose	Merck	108337
hemocytometer, Neubauer chamber	BOECO,Germany
Laminar flow hood	ESCO	AC2-6E8
L-glutamine (GlutaMAX)	Gibco by life technologies	A12860-01
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
Penicillin/Streptomycin	Gibco by life technologies	15140-122
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	4878
Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)	Falcon – Corning	BD-352008
Sodium Azide	Merck	822335
Sodium Chloride	Merck	106404
Sodium Hydroxide	Merck	106462
SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml	Tarson	500010-N
Tissue Culture Plate 6 well	BIOFIL	TCP011006
Trypan Blue	Merck	111732
Trypsin-EDTA 0.5% 10X	Gibco by life technologies	15400-054
Vortex Mixer	Labnet International, Inc.