Cantilever buigen van murine femorale nekken

Summary

Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een reproduceerbaar testplatform voor muriene femurhalzen in een sledebuigopstelling. Aangepaste 3D-geprinte geleiders werden gebruikt om de dijbenen consistent en stijf in optimale uitlijning te fixeren.

Abstract

Fracturen in de femurhals komen vaak voor bij personen met osteoporose. Veel muismodellen zijn ontwikkeld om ziektetoestanden en therapieën te beoordelen, met biomechanische testen als primaire uitkomstmaat. Traditionele biomechanische tests richten zich echter op torsie- of buigtests die worden toegepast op de middenas van de lange botten. Dit is meestal niet de plaats van hoogrisicofracturen bij osteoporotische personen. Daarom werd een biomechanisch testprotocol ontwikkeld dat de femurhalzen van muizendijbenen in cantileverbuigingsbelasting test om de soorten fracturen die osteoporosepatiënten ervaren beter te repliceren. Omdat de biomechanische uitkomsten sterk afhankelijk zijn van de buigrichting ten opzichte van de femurhals, zijn 3D-geprinte geleiders gemaakt om een femurschacht onder een hoek van 20° ten opzichte van de belastingsrichting te houden. Het nieuwe protocol stroomlijnde het testen door de variabiliteit in uitlijning te verminderen (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) en verbeterde reproduceerbaarheid in de gemeten biomechanische uitkomsten (gemiddelde COV = 26,7%). De nieuwe aanpak met behulp van de 3D-geprinte gidsen voor betrouwbare uitlijning van monsters verbetert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid door de meetfouten als gevolg van een verkeerde uitlijning van het monster te verminderen, wat de steekproefgroottes in muisstudies van osteoporose zou moeten minimaliseren.

Introduction

Fractuurrisico is een ernstige medische zorg in verband met osteoporose. Meer dan 1,5 miljoen fragiliteitsfracturen worden elk jaar alleen al in de Verenigde Staten gemeld, met fracturen in de heup, met name de femurhals, als de leidende fractuur ^type1. Geschat wordt dat 18% van de vrouwen en 6% van de mannen in hun leven een femurhalsfractuur zullen ^ervaren2, en het sterftecijfer na 1 jaar na de fractuur is groter dan 20%¹. Daarom kunnen muismodellen die biomechanische testen van de femurhals mogelijk maken, geschikt zijn voor het bestuderen van fragiliteitsfracturen. Muismodellen bieden ook krachtige hulpmiddelen om vertaalbare cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die mogelijk betrokken zijn bij osteoporose op te helderen. Dit komt door de beschikbaarheid van genetische verslaggevers, winst en verlies van functiemodellen en de uitgebreide bibliotheek van moleculaire technieken en reagentia. Mechanisch testen van muizenbotten kan de nodige uitkomstmaten bieden om de gezondheid van de botten, genotypische en fenotypische variaties te bepalen die de etiologie van de ziekte kunnen verklaren, en therapieën beoordelen op basis van uitkomstmaten van de kwaliteit van het bot en het risico op ^fracturen3.

De anatomie van de femurhals creëert unieke mechanische belastingsscenario’s, die meestal leiden tot buigfracturen (buigen). De heupkop wordt geladen in de acetabulaire kom aan het proximale uiteinde van het dijbeen. Hierdoor ontstaat een uitkragende buigingsscenario op de femurhals, die distaal stevig aan de heupschacht is ^bevestigd4. Dit verschilt van traditionele 3- of 4-punts buigtests op de femuraire mid-diafyse. Hoewel deze tests nuttig zijn, repliceren ze niet de belasting die meestal leidt tot fragiliteitsfracturen bij osteopenische en osteoporotische personen in termen van fractuurlocatie of het belastingsscenario.

Om het risico op fragiliteitsfracturen bij muizen beter te beoordelen, werd geprobeerd de reproduceerbaarheid van cantileverbuigingstests van muriene femurhalzen te verbeteren. Zoals theoretisch voorspeld, is aangetoond dat de belastingshoek op de heupkop ten opzichte van de femurschacht de uitkomstmaten aanzienlijk ^beïnvloedt5, waardoor een uitdaging ontstaat voor de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van gerapporteerde uitkomsten. Om een goede en consistente uitlijning van de dijbenen tijdens de monstervoorbereiding te garanderen, werden gidsen ontworpen en 3D-geprint op basis van anatomische metingen op μCT-scans van C57BL / 6 muisdijbenen. De geleiders zijn ontworpen om te helpen bij het consequent oppotten van de monsters, zodat de femurschacht op ~ 20 ° van de verticale belastingsrichting wordt gehouden. Deze hoek is gekozen omdat het de stijfheid maximaliseert en tegelijkertijd het maximale buigmoment langs de heupschacht minimaliseert, wat de kans op femurhalsfracturen verhoogt en leidt tot meer consistente en reproduceerbare ^tests5. Geleiders werden 3D-geprint in verschillende formaten om anatomische verschillen tussen monsters op te vangen en gebruikt om monsters in een stabiele positie te houden tijdens het oppotten in acrylbotcement. De stijfheid, maximale kracht, vloeikracht en maximale energie werden berekend uit de krachtverplaatsingsgrafieken. Deze testmethode toonde consistente resultaten voor de bovengenoemde biomechanische uitkomst. Met oefening en de hulp van de 3D-geprinte gids kunnen meetfouten als gevolg van een verkeerde uitlijning worden geminimaliseerd, wat resulteert in betrouwbare uitkomstmaten.

Protocol

Dierstudies werden goedgekeurd door het University of Rochester Committee of Animal Resources. De muizen die in deze studie werden gebruikt, waren C57BL / 6-mannetjes en -vrouwen, variërend van de leeftijd van 24-29 weken oud. Muizen werden gehuisvest in standaardomstandigheden met voedsel en water ad libitum. Bij euthanasie via kooldioxide-inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie, werden 20 rechterdijbenen (10 mannelijke en 10 vrouwelijke) geoogst en ingevroren bij -20 °C totdat ze werden getest. <p c…

Representative Results

Bij potten met behulp van de geleider werden de femurschachten uitgelijnd op 21,6° ± 1,5°. Hoewel dit <10% afwijking van de beoogde hoek van 20° vertegenwoordigt, waren de variatiecoëfficiënten (COV) van de pothoek over alle geteste monsters respectievelijk 7,6% en 6,5% voor mannelijke en vrouwelijke muizen (n = 10 per groep) zoals geverifieerd door planaire röntgenfoto's vóór de test (figuur 5). Bovendien moeten de röntgenfoto’s na het testen worden gebruikt om de modus te beoorde…

Discussion

Dit protocol schetst een betrouwbare cantilever buigtest voor murine femurhalzen. Het natuurlijke cantileverflexuurscenario dat optreedt bij de femurhals wordt meestal niet weergegeven in standaard 3- en 4-punts ^buigtests5. Deze testmethode is beter en betrouwbaarder repliceert het type femurhalsfracturen dat wordt ervaren door botfragiliteitspatiënten. De belangrijkste focus bij het uitvoeren van dit protocol is het elimineren van de variabiliteit als gevolg van inconsistente oppotting van de fe…

Materials

¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.