Flessione a sbalzo dei colli femorali murini

Summary

Il presente protocollo descrive lo sviluppo di una piattaforma di prova riproducibile per colli femorali murini in un set-up di flessione a sbalzo. Sono state utilizzate guide personalizzate stampate in 3D per fissare in modo coerente e rigido i femori in un allineamento ottimale.

Abstract

Le fratture nel collo del femore sono un evento comune negli individui con osteoporosi. Molti modelli murini sono stati sviluppati per valutare gli stati patologici e le terapie, con test biomeccanici come misura di esito primario. Tuttavia, i test biomeccanici tradizionali si concentrano su test di torsione o flessione applicati all’albero medio delle ossa lunghe. Questo non è in genere il sito di fratture ad alto rischio in individui osteoporotici. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo di test biomeccanico che testa i colli femorali dei femori murini nel carico di flessione a sbalzo per replicare meglio i tipi di fratture sperimentate dai pazienti con osteoporosi. Poiché i risultati biomeccanici dipendono fortemente dalla direzione di carico flessionale rispetto al collo del femore, sono state create guide stampate in 3D per mantenere un albero femorale con un angolo di 20 ° rispetto alla direzione di carico. Il nuovo protocollo ha semplificato i test riducendo la variabilità nell’allineamento (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) e migliorando la riproducibilità nei risultati biomeccanici misurati (COV medio = 26,7%). Il nuovo approccio che utilizza le guide stampate in 3D per un allineamento affidabile dei campioni migliora il rigore e la riproducibilità riducendo gli errori di misurazione dovuti al disallineamento del campione, che dovrebbe ridurre al minimo le dimensioni del campione negli studi sui topi sull’osteoporosi.

Introduction

Il rischio di fratture è una seria preoccupazione medica associata all’osteoporosi. Oltre 1,5 milioni di fratture da fragilità sono segnalate ogni anno solo negli Stati Uniti, con fratture che si verificano nell’anca, in particolare nel collo del femore, come il tipo di frattura ^principale1. Si stima che il 18% delle donne e il 6% degli uomini sperimenteranno una frattura del collo del femore nel corso della loro ^{vita2 e il} tasso di mortalità a 1 anno dopo la frattura è superiore al 20%¹. Pertanto, i modelli murini che consentono test biomeccanici del collo femorale possono essere adatti per studiare le fratture da fragilità. I modelli murini offrono anche potenti strumenti per chiarire gli eventi cellulari e molecolari traducibili coinvolti potenzialmente nell’osteoporosi. Ciò è dovuto alla disponibilità di reporter genetici, ai modelli di guadagno e perdita di funzione e all’ampia libreria di tecniche molecolari e reagenti. I test meccanici delle ossa di topo possono fornire le misure di esito necessarie per determinare la salute delle ossa, le variazioni genotipiche e fenotipiche che potrebbero spiegare l’eziologia della malattia e valutare le terapie in base alle misure di esito della qualità dell’osso e del rischio di ^frattura3.

L’anatomia del collo femorale crea scenari di carico meccanico unici, che in genere portano a fratture flessionali (flessione). La testa del femore è caricata nella presa acetabolare all’estremità prossimale del femore. Ciò crea uno scenario di flessione a sbalzo sul collo del femore, che è rigidamente attaccato all’albero femorale distalmente4. Questo differisce dai tradizionali test di flessione a 3 o 4 punti sulla diafisi media femorale. Sebbene questi test siano utili, non replicano il carico che in genere porta a fratture da fragilità in individui osteopenici e osteoporotici in termini di posizione della frattura o dello scenario di carico.

Per valutare meglio il rischio di frattura da fragilità nei topi, è stato cercato di migliorare la riproducibilità dei test di flessione a sbalzo dei colli femorali murini. Come teoricamente previsto, l’angolo di carico sulla testa del femore rispetto all’albero femorale ha dimostrato di influenzare in modo significativo le misure di ^esito5, creando così una sfida per l’affidabilità e la riproducibilità dei risultati riportati. Per garantire un allineamento corretto e coerente dei femori durante la preparazione del campione, sono state progettate guide e stampate in 3D sulla base di misurazioni anatomiche effettuate su scansioni μCT di femori di topo C57BL / 6. Le guide sono state progettate per aiutare a invasare costantemente i campioni in modo tale che l’albero femorale sia mantenuto a ~ 20 ° dalla direzione di carico verticale. Questo angolo è stato scelto perché massimizza la rigidità riducendo al minimo il momento di flessione massima lungo l’albero femorale, che aumenta la probabilità di fratture del collo del femore e porta a test più coerenti e ^{riproducibili5}. Le guide sono state stampate in 3D in varie dimensioni per adattarsi alle differenze anatomiche tra i campioni e utilizzate per tenere i campioni in una posizione stabile durante l’invasatura in cemento osseo acrilico. La rigidità, la forza massima, la forza di snervamento e l’energia massima sono state calcolate dai grafici forza-spostamento. Questo metodo di test ha mostrato risultati coerenti per il suddetto risultato biomeccanico. Con la pratica e l’aiuto della guida stampata in 3D, gli errori di misurazione dovuti al disallineamento possono essere ridotti al minimo, con conseguenti misure di risultato affidabili.

Protocol

Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato per le risorse animali dell’Università di Rochester. I topi utilizzati in questo studio erano C57BL / 6 maschi e femmine di età compresa tra 24 e 29 settimane di età. I topi erano alloggiati in condizioni standard con cibo e acqua ad libitum. Dopo l’eutanasia per inalazione di anidride carbonica, seguita da lussazione cervicale, 20 femori destri (10 maschi e 10 femmine) sono stati raccolti e congelati a -20 ° C fino al test. …

Representative Results

Quando invasati con l’aiuto della guida, gli alberi femorali sono stati allineati a 21,6 ° ± 1,5 °. Mentre questo rappresenta una deviazione del <10% dall'angolo previsto di 20°, i coefficienti di variazione (COV) dell'angolo di invasatura su tutti i campioni testati erano rispettivamente del 7,6% e del 6,5% per topi maschi e femmine (n = 10 per gruppo) come verificato dai raggi X planari pre-test (Figura 5). Inoltre, i raggi X post-test dovrebbero essere utilizzati per valutare la modal…

Discussion

Questo protocollo delinea un test di flessione a sbalzo affidabile per i colli femorali murini. Lo scenario naturale di flessione a sbalzo che si verifica al collo del femore non è in genere rappresentato nei test di flessione standard a 3 e 4 ^punti5. Questo metodo di test è migliore e replica in modo più affidabile il tipo di fratture del collo del femore sperimentate dai pazienti con fragilità ossea. L’obiettivo principale quando si esegue questo protocollo è eliminare la variabilità dovut…

Materials

¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.