Cantilever bøyning av Murine Femoral Necks

Summary

Den nåværende protokollen beskriver utviklingen av en reproduserbar testplattform for murine lårhalser i et cantilever bøyeoppsett. Tilpassede 3D-trykte guider ble brukt til å konsekvent og stivt fikse lårbenene i optimal justering.

Abstract

Brudd i lårhalsen er en vanlig forekomst hos personer med osteoporose. Mange musemodeller er utviklet for å vurdere sykdomstilstander og terapier, med biomekanisk testing som et primært resultatmål. Imidlertid fokuserer tradisjonell biomekanisk testing på torsjons- eller bøyetester som brukes på midtakselen av de lange beinene. Dette er vanligvis ikke stedet for høyrisikofrakturer hos osteoporotiske individer. Derfor ble det utviklet en biomekanisk testprotokoll som tester lårhalsene til murine lårben i cantilever bøyebelastning for å gjenskape bedre typer brudd som oppleves av osteoporosepasienter. Siden de biomekaniske resultatene er svært avhengige av den fleksible lasteretningen i forhold til lårhalsen, ble 3D-trykte guider opprettet for å opprettholde en låraksel i en vinkel på 20° i forhold til lasteretningen. Den nye protokollen strømlinjeformet testingen ved å redusere variasjonen i justering (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) og forbedret reproduserbarhet i de målte biomekaniske resultatene (gjennomsnittlig COV = 26,7%). Den nye tilnærmingen ved hjelp av 3D-trykte guider for pålitelig prøvejustering forbedrer strenghet og reproduserbarhet ved å redusere målefeilene på grunn av prøvefeiljustering, noe som bør minimere prøvestørrelser i musestudier av osteoporose.

Introduction

Bruddrisiko er en alvorlig medisinsk bekymring forbundet med osteoporose. Over 1,5 millioner skjørhetsfrakturer rapporteres hvert år bare i USA, med brudd i hoften, spesielt lårhalsen, som den ledende ^bruddtypen1. Det er anslått at 18% av kvinnene og 6% av mennene vil oppleve et lårhalsbrudd i løpet av ^livet2, og dødeligheten ved 1 år etter bruddet er større enn 20%¹. Derfor kan musemodeller som tillater biomekanisk testing av lårhalsen være egnet for å studere skjørhetsfrakturer. Musemodeller tilbyr også kraftige verktøy for å belyse overførbare cellulære og molekylære hendelser involvert i osteoporose potensielt. Dette skyldes tilgjengeligheten av genetiske reportere, gevinst og tap av funksjonsmodeller, og det ekspansive biblioteket med molekylære teknikker og reagenser. Mekanisk testing av museben kan gi nødvendige utfallstiltak for å bestemme beinhelse, genotypiske og fenotypiske variasjoner som kan forklare sykdommens etiologi, og vurdere terapier basert på utfallsmål for beinets kvalitet og risikoen for ^brudd3.

Anatomien til lårhalsen skaper unike mekaniske lastescenarier, noe som vanligvis fører til fleksurale (bøyende) brudd. Lårhodet er lastet i acetabulær stikkontakt i den proksimale enden av lårbenet. Dette skaper et cantilever bøyescenario på lårhalsen, som er stivt festet til lårakselen ^distally4. Dette skiller seg fra tradisjonelle 3- eller 4-punkts bøyetester på lårbenet midtdiafyse. Selv om disse testene er nyttige, replikerer de ikke lasten som vanligvis fører til skjørhetsfrakturer hos osteopeniske og osteoporotiske individer når det gjelder bruddplassering eller lastescenario.

For bedre å vurdere skjørhetsbruddrisiko hos mus, ble det forsøkt å forbedre reproduserbarheten av cantilever bøyetester av murine lårhalser. Som teoretisk anslått har lastevinkelen på lårhodet i forhold til lårakselen vist seg å påvirke utfallstiltakene5 betydelig, og dermed skape en utfordring for pålitelighet og reproduserbarhet av rapporterte resultater. For å sikre riktig og konsistent justering av lårbenene under prøvepreparering, ble guider designet, og 3D trykt basert på anatomiske målinger gjort på μCT-skanninger av C57BL / 6 muse lårben. Føringene ble designet for å hjelpe til med å konsekvent potte prøvene slik at lårakselen opprettholdes ved ~ 20 ° fra den vertikale lasteretningen. Denne vinkelen ble valgt fordi den maksimerer stivheten samtidig som den minimerer det maksimale bøyemomentet langs lårakselen, noe som øker sannsynligheten for lårhalsbrudd og fører til mer konsistent og reproduserbar ^testing5. Guider ble 3D trykt i forskjellige størrelser for å imøtekomme anatomiske forskjeller mellom prøver og brukes til å holde prøver i en stabil posisjon mens potting i akrylbensement. Stivheten, maksimal kraft, utbyttekraft og maksimal energi ble beregnet ut fra kraftforskyvningsgrafene. Denne testmetoden viste konsistente resultater for det nevnte biomekaniske utfallet. Med øvelse og hjelp av den 3D-trykte guiden kan målefeil på grunn av feiljustering minimeres, noe som resulterer i pålitelige utfallstiltak.

Protocol

Dyrestudier ble godkjent av University of Rochester Committee of Animal Resources. Musene som ble brukt i denne studien var C57BL/6 menn og kvinner fra 24-29 uker. Mus ble plassert i standardforhold med mat og vann ad libitum. Ved eutanasi via karbondioksidinnånding, etterfulgt av cervical dislokasjon, ble 20 høyre lårben (10 hann og 10 kvinner) høstet og frosset ved -20 °C til de ble testet. 1. Opprettelse av tilpassede 3D-trykte monteringsveiledninger <p clas…

Representative Results

Ved potte ved hjelp av føringen ble lårakslene justert ved 21,6° ± 1,5°. Selv om dette representerer <10 % avvik fra den tiltenkte vinkelen på 20 °, var variasjonskoeffisientene (COV) til pottevinkelen på tvers av alle prøvene som ble testet henholdsvis 7,6 % og 6,5 % for mannlige og kvinnelige mus (n = 10 per gruppe) som verifisert av pre-test plane røntgenstråler (figur 5). I tillegg bør røntgenbildene etter testing brukes til å vurdere modusen der prøvene mislyktes. Svikt b…

Discussion

Denne protokollen skisserer en pålitelig cantilever bøyningstest for murine lårhalser. Det naturlige cantilever flexure-scenariet som oppstår ved lårhalsen er vanligvis ikke representert i standard 3- og 4-punkts ^bøyetester5. Denne testmetoden er bedre og mer pålitelig replikerer typen lårhalsbrudd som oppleves av beinskjørhetspasienter. Hovedfokuset når du utfører denne protokollen er å eliminere variasjonen på grunn av inkonsekvent potting av lårakselen. Kritisk, følg trinnene som…

Materials

¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.