Hochdurchsatzanalyse der nicht-photochemischen Abschreckung in Kulturpflanzen mittels pulsamplitudenmodulierter Chlorophyllfluorometrie

Summary

Das Protokoll führt eine Hochdurchsatzmethode zur Messung der Relaxation der nicht-photochemischen Abschreckung durch pulsamplitudenmodulierte Chlorophyllfluorometrie ein. Die Methode wird auf feldgezüchtetes Glycine max angewendet und kann an andere Arten angepasst werden, um nach genetischer Vielfalt oder Brutpopulationen zu suchen.

Abstract

Die Photosynthese ist in modernen Pflanzensorten nicht optimiert und bietet daher eine Möglichkeit zur Verbesserung. Die Beschleunigung der Entspannung des nicht-photochemischen Abschreckens (NPQ) hat sich als effektive Strategie zur Steigerung der photosynthetischen Leistung erwiesen. Das Potenzial zur Züchtung für einen verbesserten NPQ und ein vollständiges Verständnis der genetischen Basis der NPQ-Entspannung fehlt jedoch aufgrund von Einschränkungen bei der Überstichprobenziehung und Datenerhebung von Feldkulturpflanzen. Aufbauend auf früheren Berichten präsentieren wir einen Hochdurchsatz-Assay zur Analyse der NPQ-Relaxationsraten in Glycine max (Sojabohne) unter Verwendung der pulsamplitudenmodulierten (PAM) Chlorophyllfluorometrie. Blattscheiben werden aus Feldsojabohnen beprobt, bevor sie in ein Labor transportiert werden, in dem die NPQ-Relaxation in einem geschlossenen PAM-Fluorometer gemessen wird. Die NPQ-Relaxationsparameter werden berechnet, indem den gemessenen NPQ-Werten nach einem Übergang von hohem zu schwachem Licht eine biexponentielle Funktion zugeordnet wird. Mit dieser Methode ist es möglich, Hunderte von Genotypen innerhalb eines Tages zu testen. Das Verfahren hat das Potenzial, Mutanten- und Diversitätspanels auf Variationen in der NPQ-Relaxation zu untersuchen, und kann daher sowohl auf grundlegende als auch auf angewandte Forschungsfragen angewendet werden.

Introduction

Die Photosynthese besteht aus Lichtabsorption, Primärelektronentransfer, Energiestabilisierung und der Synthese und dem Transport von photosynthetischen Produkten¹. Das Verständnis jedes Schritts ist von entscheidender Bedeutung, um die Bemühungen zur Steigerung der photosynthetischen Effizienz von Pflanzen zu steuern. Licht beeinflusst die Photosyntheserate und erfordert eine ausgleichende Energieversorgung in Form von Photonen, wobei die Nachfrage nach reduzierenden Äquivalenten besteht. Wenn das Angebot die Nachfrage übersteigt, zum Beispiel bei hohem Licht oder während einer reduzierten CO 2-Fixierung, die durch einen Verschluss der Stomata verursacht wird, erhöht der Aufbau von abnehmender Leistung die Wahrscheinlichkeit der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies mit dem Potenzial, den photosynthetischen Apparat zu schädigen und den Elektronentransport zu beeinträchtigen. Um Schäden zu vermeiden, haben Pflanzen daher mehrere Lichtschutzmechanismen entwickelt, darunter die Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies und die nicht-photochemische Abschreckung der angeregten Chlorophyllzustände (NPQ)².

Die Aufrechterhaltung hoher Photosyntheseraten ist in einer Feldumgebung eine Herausforderung. Saisonale und tägliche Veränderungen, zusammen mit Umweltschwankungen wie windinduzierten Blattbewegungen und vorübergehender Wolkendecke, verursachen Verschiebungen in der Menge und Intensität des Lichts, das Pflanzen für die Photosynthese erhalten³. NPQ leitet überschüssige Lichtenergie ab und kann dazu beitragen, Lichtschäden zu vermeiden, während gleichzeitig eine anhaltende Photosyntheserate bei hohem Licht^{ermöglicht wird 4}. Ein anhaltender NPQ während der Übergänge bei hohem bis niedrigem Licht führt jedoch weiterhin Energie ab, die für die Kohlenstoffreduktion verwendet werden könnte⁵. Infolgedessen kann die Beschleunigung der Relaxation von NPQ die Effizienz der Photosynthese^{erhöhen 6}, was die NPQ-Relaxation zu einem attraktiven Ziel für die Verbesserung der Ernte macht.

Die Analyse der pulsamplitudenmodulierten Chlorophyllfluoreszenz (PAM) kann verwendet werden, um den NPQ aus messbaren Parametern zu berechnen (Ergänzende Tabelle 1 und Ergänzende Tabelle 2)7,8,9. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Bestimmung der NPQ-Entspannungsraten in Feldkulturpflanzen zum Zwecke des Screenings der natürlichen Variation im Keimplasma. Die PAM-Chlorophyll-Fluorometrie-Analyse kann jedoch auch für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, die auf Arten von Algen bis hin zu höheren Pflanzen angewendet werden, und wird an anderer Stelle überprüft ^7,8,9.

In einem dunkel angepassten Blatt oder einer dunkel angepassten Zelle sind die Reaktionszentren des Photosystems II (PSII) offen, um Elektronen zu empfangen, und es gibt keinen NPQ. Das Einschalten eines Messlichts mit geringer Intensität löst Chlorophyllfluoreszenz aus, während der Elektronentransport durch PSII vermieden wird. Die aufgezeichnete minimale Fluoreszenz in diesem dunkelangepassten Zustand wird durch den Parameter F_{o beschrieben}. Das Anlegen eines hochintensiven Lichtpulses an ein dunkel angepasstes Blatt kann den ersten stabilen Elektronenakzeptorpool von Chinonen, die an die Chinon-A-Stelle gebunden sind, schnell reduzieren. Dies blockiert vorübergehend die Elektronentransferkapazität in PSII-Reaktionszentren, von denen dann gesagt wird, dass sie geschlossen sind und keine Elektronen aus der Wasserspaltung empfangen können. Durch die Verwendung einer kurzen Pulsdauer bleibt nicht genügend Zeit, um den NPQ zu stimulieren. Die resultierende Chlorophyllfluoreszenz entspricht dem maximalen Wert, der in Abwesenheit von NPQ oder maximaler Fluoreszenz F _{m erreicht} werden kann. Die Differenz zwischen minimaler und maximaler Fluoreszenz wird als variable Fluoreszenz, F_v. Die maximale photochemische Quantenausbeute des Photosystems II (F _v/F_m) wird aus diesen beiden Parametern unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:

F_v/F m = (F m-F_o)/F _m

Dies kann einen wichtigen Indikator für die Funktion und Belastung des Photosystems liefern. Das Einschalten eines aktinischen (photosynthetischen) Lichts stimuliert die nicht-photochemische Abschreckung, und die anschließende Anwendung eines Sättigungsblitzes ermöglicht die Messung der lichtangepassten maximalen Fluoreszenz, F_m‘. Durch den Vergleich der Differenz zwischen dunkler und lichtangepasster maximaler Fluoreszenz kann der NPQ nach der Stern-Volmer-Gleichung¹⁰ berechnet werden:

NPQ = F m/F_m‘_– 1

In höheren Anlagen wurde NPQ als aus mindestens fünf verschiedenen Komponenten bestehend beschrieben, darunter qE, qT, qZ, qI und qH. Die genauen Mechanismen, die mit dem NPQ verbunden sind, sind nicht vollständig verstanden; qE gilt jedoch in den meisten Anlagen als Hauptkomponente des NPQ. Zu den entscheidenden Faktoren für das vollständige Engagement von qE gehören der Aufbau eines Protonengradienten über die Thylakoidmembran, die Aktivität der Photosystem II-Untereinheit S 11,12 und de-epoxidierte Xanthophylle, Antheraxanthin^, Lutein und insbesondere Zeaxanthin¹³. qE entspannt die schnellste aller NPQ-Komponenten (< 2 min)¹⁴, und die reversible Aktivierung von qE ist daher besonders wichtig für die Anpassung an wechselnde Lichtintensitäten. Eine zweite langsamere Phase der NPQ-Relaxation (~ 2-30 min) umfasst sowohl qT, bezogen auf Zustandsübergänge, als auch qZ, einschließlich der Interkonversion von Zeaxanthin zu Violaxanthin¹⁵. Langsame Entspannung (> 30 min) von NPQ kann sowohl photoinhibitorisches Quenching (qI)¹⁶ als auch Prozesse unabhängig von Lichtschäden 17,18 umfassen, wie qH, das ein anhaltendes Abschrecken in den peripheren Antennen von PSII ist, das durch ein plastides Lipocalinprotein ^19,20 vermittelt wird.

Der NPQ steigt bei starker Lichteinstrahlung. Die anschließende Übertragung auf schwaches Licht kann zu einer Herunterregulierung des NPQ führen. Der Zerfall von schnellen, mittleren und langsamen Entspannungsphasen kann in den Parametern einer biexponentiellen Funktion erfasst werden 15,21,22,23

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

Die theoretische Grundlage für die biexponentielle Funktion basiert auf der Annahme der Verwendung hypothetischer Quencher erster Ordnung, einschließlich qE (Aq1), der kombinierten Relaxation von qZ und qT (Aq2) mit den entsprechenden Zeitkonstanten τq1 und τq2 und des langfristigen NPQ, der qI- und photoschadenunabhängige Prozesse (Aq3) umfasst. Daher bietet die biexponentielle Funktion eine realistischere Darstellung der mehreren miteinander verbundenen biologischen Prozesse, die an der Abschreckung der Chlorophyllfluoreszenz beteiligt sind, verglichen mit einer einfacheren Hill-Gleichung, der eine theoretische Grundlage fehlt²⁴.

Der NPQ kann mit einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen PAM-Fluorometern^25,26 gemessen werden^, von einfachen Handgeräten 27 bis hin zu fortschrittlicheren geschlossenen Systemen ^28. Eine Einschränkung einiger dieser Ansätze ist jedoch ein relativ niedriger Durchsatz, was das Screening großer Pflanzensammlungen ohne mehrere Geräte und ein Forscherteam schwierig macht. Um dieses Problem anzugehen, entwickelten McAusland et al. ein Verfahren, das auf ausgeschnittenem Blattgewebe basierte, und nutzten es, um Unterschiede in der Chlorophyllfluoreszenz zwischen zwei Weizensorten^{zu identifizieren 29}. Der Reiz dieses Ansatzes besteht darin, dass die Abbildung von Blattscheiben, die mit einem einzigen Gerät von mehreren Pflanzen stammen, das Screening von Hunderten von Genotypen innerhalb eines Tages erleichtern kann. Dies ermöglicht es, die Variation der NPQ-Relaxation im Rahmen genomweiter Assoziationsstudien oder für das Screening von Zuchtpopulationen zu bewerten, die das Potenzial haben, die photosynthetische Effizienz und letztendlich den Ertrag von Pflanzen zu steigern.

Aufbauend auf den Erkenntnissen von McAusland et ^al.29 verwenden wir die PAM-Chlorophyllfluoreszenzanalyse von Blattscheiben für das Hochdurchsatz-Screening der NPQ-Relaxationsraten in Glycine max (G.max; Sojabohne). Dieses Protokoll verwendet den CF Imager²⁵, der mit anderen kommerziell erhältlichen geschlossenen PAM-Systemen wie der beliebten FluorCam²⁶ vergleichbar ist. Mit einem dunklen Raum für die Anpassung von Proben können Benutzer 96-Well-Teller, Petrischalen und kleine Pflanzen abbilden. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Erhöhung des Durchsatzes durch die Verwendung von Blattscheiben im Vergleich zur sequenziellen Analyse einzelner Pflanzen. Hierin stellen wir repräsentative Ergebnisse und eine Methode zur Probenahme, Messung und Analyse des NPQ in Feldkulturpflanzen vor.

Protocol

1. Saatgutpflanzung Wählen Sie einen Feldstandort mit fruchtbarem, gut durchlässigem, aber nicht sandigem Boden und einem pH-Wert von fast 6,5. Markieren Sie 1,2 m Reihendiagramme mit 0,75 m Abstand, indem Sie den Boden mit einer Hacke ritzen. Pflanzen Sie 50 Samen/m von G.max cv. IA3023 in 3 cm Tiefe entlang jeder Parzelle zu Beginn der Vegetationsperiode, wenn die Bodentemperaturen zwischen 25 und 30 °C liegen.HINWEIS: Für das Screening der genetischen Vielfalt wird…

Representative Results

Abbildung 1A zeigt eine typische Messung des NPQ in Feldsojabohnen. Pflanzen wurden im Sommer 2021 in Urbana, IL (Breitengrad 40,084604°, Längengrad -88,227952°) angebaut, wobei die Samen am 5. Juni gepflanzt wurden. 2021. Die Blattscheiben wurden nach 30 Tagen der Pflanzung von Samen beprobt und Messungen wurden mit dem bereitgestellten Protokoll durchgeführt (Tabelle 1). F v/Fm- und NPQ-Werte wurden für jede Blattscheibe berechnet (Ergänzend…

Discussion

Die sorgfältige Auswahl und Handhabung von Blattscheiben ist entscheidend, um zuverlässige Messungen des NPQ zu erhalten. Erstens führt eine Schädigung des Gewebes, wie z. B. die grobe Handhabung mit einer Pinzette, zu Stress, was zu niedrigen Werten für die maximale Quanteneffizienz der Photosynthese führt. Nicht gestresste Pflanzen haben typischerweise F_v / _{F m-Werte} von etwa 0,83^{bis 18}, wobei signifikante Rückgänge auf eine Verringerung der photos…

Materials

24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America