Análisis de alto rendimiento del enfriamiento no fotoquímico en cultivos mediante fluorometría de clorofila modulada por amplitud de pulso

Summary

El protocolo introduce un método de alto rendimiento para medir la relajación del enfriamiento no fotoquímico mediante fluorometría de clorofila modulada por amplitud de pulso. El método se aplica a Glycine max cultivada en el campo y se puede adaptar a otras especies para detectar la diversidad genética o las poblaciones reproductoras.

Abstract

La fotosíntesis no está optimizada en las variedades de cultivos modernos y, por lo tanto, brinda una oportunidad de mejora. Acelerar la relajación del enfriamiento no fotoquímico (NPQ) ha demostrado ser una estrategia efectiva para aumentar el rendimiento fotosintético. Sin embargo, el potencial de reproducirse para mejorar el NPQ y una comprensión completa de la base genética de la relajación del NPQ es deficiente debido a las limitaciones del sobremuestreo y la recopilación de datos de las plantas de cultivo cultivadas en el campo. Sobre la base de informes anteriores, presentamos un ensayo de alto rendimiento para el análisis de las tasas de relajación de NPQ en Glycine max (soja) utilizando fluorometría de clorofila de amplitud modulada por pulso (PAM). Los discos de hoja se muestrean de soja cultivada en el campo antes de su transporte a un laboratorio donde se mide la relajación de NPQ en un fluorómetro PAM cerrado. Los parámetros de relajación de NPQ se calculan ajustando una función biexponencial a los valores de NPQ medidos después de una transición de luz alta a baja. Usando este método, es posible probar cientos de genotipos en un día. El procedimiento tiene el potencial de detectar paneles mutantes y de diversidad para detectar la variación en la relajación de NPQ y, por lo tanto, se puede aplicar tanto a preguntas de investigación fundamentales como aplicadas.

Introduction

La fotosíntesis consiste en la absorción de luz, la transferencia primaria de electrones, la estabilización de energía y la síntesis y transporte de productos fotosintéticos¹. Comprender cada paso es vital para guiar los esfuerzos para aumentar la eficiencia fotosintética de los cultivos. La luz afecta la velocidad de la fotosíntesis, lo que requiere equilibrar el suministro de energía, en forma de fotones, con la demanda de equivalentes reductores. Cuando la oferta excede la demanda, por ejemplo, bajo mucha luz o durante la fijación reducida de CO₂ causada por el cierre estomático, la acumulación de potencia reductora aumenta la probabilidad de formación de especies reactivas de oxígeno con el potencial de dañar el aparato fotosintético y perjudicar el transporte de electrones. Por lo tanto, para prevenir daños, las plantas han desarrollado varios mecanismos de fotoprotección, incluida la desintoxicación de especies reactivas de oxígeno y el enfriamiento no fotoquímico de los estados de clorofila excitada (NPQ)².

Mantener altas tasas de fotosíntesis es un desafío en un entorno de campo. Los cambios estacionales y diurnos, junto con las fluctuaciones ambientales, como los movimientos de las hojas inducidos por el viento y la nubosidad transitoria, causan cambios en la cantidad e intensidad de la luz recibida por las plantas para la fotosíntesis³. NPQ disipa el exceso de energía de la luz y puede ayudar a prevenir el daño fotográfico al tiempo que permite tasas sostenidas de fotosíntesis con mucha luz⁴. Sin embargo, la NPQ prolongada durante las transiciones de alta a baja luz continúa disipando la energía que podría usarse para la reducción de carbono⁵. Como resultado, acelerar la relajación de NPQ puede aumentar la eficiencia de la fotosíntesis⁶, haciendo de la relajación de NPQ un objetivo atractivo para la mejora de cultivos.

El análisis de fluorescencia de clorofila modulada por amplitud de pulso (PAM) se puede utilizar para calcular el NPQ a partir de parámetros medibles (Tabla suplementaria 1 y Tabla suplementaria 2)^7,8,9. Este artículo se centra en determinar las tasas de relajación de NPQ en plantas cultivadas en el campo con el fin de detectar la variación natural en el germoplasma. Sin embargo, el análisis de fluorometría de clorofila PAM también se puede utilizar para una amplia variedad de propósitos, aplicado a especies que van desde algas hasta plantas superiores, y se revisa en otros lugares ^7,8,9.

En una hoja o célula adaptada a la oscuridad, los centros de reacción del fotosistema II (PSII) están abiertos para recibir electrones y no hay NPQ. Encender una luz de medición de baja intensidad provoca fluorescencia de clorofila al tiempo que evita el transporte de electrones a través de PSII. La fluorescencia mínima registrada en este estado adaptado a la oscuridad se describe mediante el parámetro F_o. La aplicación de un pulso de luz de alta intensidad a una hoja adaptada a la oscuridad puede reducir rápidamente el primer grupo estable de aceptores de electrones de quinonas unidas al sitio de la quinona A. Esto bloquea temporalmente la capacidad de transferencia de electrones en los centros de reacción PSII, que luego se dice que están cerrados y no pueden recibir electrones de la división del agua. Al usar una duración de pulso corta, no hay tiempo suficiente para estimular npq. La fluorescencia de clorofila resultante es equivalente al valor máximo obtenible en ausencia de NPQ, o fluorescencia máxima, F_m. La diferencia entre fluorescencia mínima y máxima se conoce como fluorescencia variable, F_v. El rendimiento cuántico fotoquímico máximo del fotosistema II (F_v/F_m) se calcula a partir de estos dos parámetros utilizando la siguiente ecuación:

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Esto puede proporcionar un indicador importante de la función del fotosistema y el estrés. Encender una luz actínica (fotosintética) estimula el enfriamiento no fotoquímico, y la posterior aplicación de un flash saturador permite la medición de la fluorescencia máxima adaptada a la luz, F_m‘. Al comparar la diferencia entre la fluorescencia máxima oscura y la adaptada a la luz, el NPQ se puede calcular de acuerdo con la ecuación de Stern-Volmer¹⁰:

NPQ = F_m/F_m‘ – 1

En plantas superiores, se ha descrito que npQ consta de al menos cinco componentes distintos, incluidos qE, qT, qZ, qI y qH. Los mecanismos precisos que intervienen en el PNP no se comprenden plenamente; sin embargo, qE se considera el componente principal de NPQ en la mayoría de las plantas. Se ha encontrado que los factores cruciales para la participación total de la qE incluyen la acumulación de un gradiente de protones a través de la membrana tilacoidea, la actividad del fotosistema II subunidad S ^11,12 y las xantofilas desoxidadas, la anteraxantina, la luteína y, en particular, la zeaxantina¹³. qE relaja el más rápido de cualquier componente NPQ (< 2 min)¹⁴, y la activación reversible de qE es, por lo tanto, particularmente importante para la adaptación a las intensidades de luz cambiantes. Una segunda fase más lenta de relajación de NPQ (~ 2-30 min) abarca tanto qT, relacionada con las transiciones de estado, como qZ, que implica la interconversión de zeaxantina a violaxantina¹⁵. La relajación lenta (> 30 min) de NPQ puede incluir tanto el enfriamiento fotoinhibitorio (qI)¹⁶ como procesos independientes del fotodaño^17,18, como qH, que es un enfriamiento sostenido en las antenas periféricas de PSII mediado por una proteína plastid lipocalina^19,20.

La NPQ aumenta durante la exposición a la luz alta. La transferencia posterior a poca luz puede resultar en una regulación a la baja del NPQ. La desintegración de las fases relajantes rápidas, intermedias y lentas se puede capturar en los parámetros de una función^{biexponencial} 15,21,22,23

NPQ = Aq1^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

La base teórica para la función biexponencial se basa en el supuesto de la utilización de primer orden de quenchers hipotéticos, incluyendo qE (Aq1), la relajación combinada de qZ y qT (Aq2), con las correspondientes constantes de tiempo τq1 y τq2, y NPQ a largo plazo, que incluye qI y procesos independientes de fotodaño (Aq3). Como tal, la función biexponencial proporciona una representación más realista de los múltiples procesos biológicos conectados involucrados en el enfriamiento de la fluorescencia de clorofila en comparación con una ecuación de Hill más simple que carece de una base teórica²⁴.

NpQ se puede medir utilizando una variedad de fluorómetros PAM disponibles comercialmente^25,26, desde simples dispositivos de mano²⁷ hasta sistemas cerrados más avanzados²⁸. Sin embargo, una limitación de varios de estos enfoques es un rendimiento relativamente bajo, lo que hace que la detección de grandes colecciones de plantas sea un desafío sin múltiples dispositivos y un equipo de investigadores. Para abordar este problema, McAusland et al. desarrollaron un procedimiento basado en el tejido foliar extirpado y lo utilizaron para identificar diferencias en la fluorescencia de clorofila entre dos cultivares de trigo²⁹. El atractivo de este enfoque es que la obtención de imágenes de discos de hojas, tomadas de múltiples plantas con un solo dispositivo, puede facilitar la detección de cientos de genotipos en un día. Esto permite evaluar la variación en la relajación de NPQ como parte de los estudios de asociación de todo el genoma, o para detectar poblaciones reproductoras con el potencial de aumentar la eficiencia fotosintética de los cultivos y, en última instancia, el rendimiento.

Sobre la base de los hallazgos de McAusland et ^al.29, utilizamos el análisis de fluorescencia de clorofila PAM de discos foliares para el cribado de alto rendimiento de las tasas de relajación de NPQ en Glycine max (G.max; soja). Este protocolo utiliza el CF Imager²⁵, que es comparable a otros sistemas pam cerrados disponibles comercialmente, como la popular FluorCam²⁶. Con una sala oscura para la adaptación de muestras, los usuarios pueden obtener imágenes de placas de 96 pocillos, placas de Petri y plantas pequeñas. La ventaja clave de este enfoque es el aumento en el rendimiento que ofrece el uso de discos de hoja en comparación con el análisis secuencial de plantas individuales. A continuación presentamos resultados representativos y un método para el muestreo, la medición y el análisis de NPQ en plantas cultivadas en el campo.

Protocol

1. Siembra de semillas Elija un sitio de campo con suelo fértil, bien drenado, pero no arenoso, y con un pH de casi 6.5. Marque parcelas de 1,2 m de fila con un espaciado de 0,75 m anotando el suelo con una azada. Plantar 50 semillas/m de G.max cv. IA3023 a 3 cm de profundidad a lo largo de cada parcela al comienzo de la temporada de crecimiento cuando las temperaturas del suelo estén entre 25 y 30 °C.NOTA: Con el propósito de evaluar la diversidad genética, se esper…

Representative Results

La Figura 1A muestra una medición típica del NPQ en la soja cultivada en el campo. Las plantas se cultivaron en Urbana, IL (latitud 40.084604°, longitud -88.227952°) durante el verano de 2021, con semillas plantadas el 5 de junio. 2021. Los discos foliares fueron muestreados después de 30 días de siembra de semillas, y se realizaron mediciones con el protocolo proporcionado (Tabla 1). Se calcularon los valores de Fv/Fm y NPQ para cada disco fo…

Discussion

La elección cuidadosa y el manejo de los discos de hoja son fundamentales para obtener mediciones confiables de NPQ. En primer lugar, el daño al tejido, como el manejo brusco con pinzas, introducirá estrés, lo que resultará en valores bajos para la máxima eficiencia cuántica de la fotosíntesis. Las plantas no estresadas suelen tener valores de F_v/F_m de alrededor de 0,83¹⁸, con disminuciones significativas que indican una reducción en el rendimiento …

Materials

24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America