تضخيم الإشريكية القولونية في رقاقة الموائع الدقيقة PCR ذات التدفق المستمر واكتشافها باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الشعري
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية بناء نظام سلسلة بوليميراز التدفق المستمر على أساس شريحة الموائع الدقيقة وكيفية بناء نظام الرحلان الكهربائي الشعري في المختبر. يقدم طريقة بسيطة لتحليل الأحماض النووية في المختبر.
Abstract
تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو طريقة تقليدية تستخدم لتضخيم الجين المستهدف الذي لعب دورا مهما في التشخيص الجزيئي الحيوي. ومع ذلك ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي يستغرق وقتا طويلا للغاية بسبب كفاءة تباين درجات الحرارة المنخفضة. يقترح هذا العمل نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل المستمر التدفق (CF-PCR) على أساس شريحة الموائع الدقيقة. يمكن تقليل وقت التضخيم بشكل كبير عن طريق تشغيل محلول PCR في قناة صغيرة موضوعة على سخانات مضبوطة في درجات حرارة مختلفة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الرحلان الكهربائي الشعري (CE) هو طريقة مثالية للتمييز بين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية والكاذبة ، فقد تم بناء نظام CE لتحقيق الفصل الفعال لشظايا الحمض النووي. تصف هذه الورقة عملية تضخيم الإشريكية القولونية (E. coli) بواسطة نظام CF-PCR المدمج داخليا والكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة CE. تظهر النتائج أن الجين المستهدف من E. coli قد تم تضخيمه بنجاح في غضون 10 دقائق ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذين النظامين للتضخيم السريع والكشف عن الأحماض النووية.
Introduction
تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو تقنية بيولوجيا جزيئية تستخدم لتضخيم شظايا معينة من الحمض النووي ، وبالتالي تضخيم كميات ضئيلة من الحمض النووي مئات الملايين من المرات. لقد تم استخدامه على نطاق واسع في التشخيص السريري ، والبحوث الطبية ، وسلامة الأغذية ، وتحديد الطب الشرعي ، وغيرها من المجالات. تتكون عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل أساسي من ثلاث خطوات: تمسخ عند 90-95 درجة مئوية ، والتلدين عند 50-60 درجة مئوية ، والتمديد عند 72-77 درجة مئوية. تعد الدورة الحرارية جزءا مهما من عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل ؛ ومع ذلك ، فإن جهاز تدوير الدراجات الحرارية PCR التقليدي ليس ضخما فحسب ، بل غير فعال أيضا ، ويتطلب حوالي 40 دقيقة لإكمال 25 دورة. للتغلب على هذه القيود ، تم بناء نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل المستمر التدفق (CF-PCR) داخليا ، استنادا إلى شريحة الموائع الدقيقة. يمكن أن يوفر CF-PCR الوقت بشكل كبير عن طريق دفع حل PCR إلى القنوات الدقيقة الموضوعة على السخانات في درجات حرارة مختلفة1،2،3،4،5.
نظرا لأن الرحلان الكهربائي الشعري (CE) له العديد من المزايا ، مثل الدقة العالية والسرعة العالية والتكاثر الممتاز6،7،8،9،10،11 ، فقد أصبح أداة شائعة في المختبر لتحليل الأحماض النووية والبروتينات. ومع ذلك ، فإن معظم المختبرات ، وخاصة المختبرات في العالم النامي ، لا تستطيع تحمل تكلفة هذه التكنولوجيا بسبب ارتفاع سعر أداة CE. هنا ، حددنا بروتوكولات لكيفية تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة CF-PCR وكيفية بناء نظام CE متعدد الاستخدامات في المختبر. نوضح أيضا عملية تضخيم الإشريكية القولونية بواسطة نظام CF-PCR هذا واكتشاف منتجات PCR بواسطة نظام CE. باتباع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول ، يجب أن يكون المستخدمون قادرين على تصنيع رقائق الموائع الدقيقة ، وإعداد حلول تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وبناء نظام CF-PCR لتضخيم الحمض النووي ، وإنشاء نظام CE بسيط ، حتى مع الموارد المحدودة ، لفصل شظايا الحمض النووي.
Protocol
Representative Results
Discussion
كل من PCR و CE هما تقنيتان حيويتان شائعتان في تحليل الأحماض النووية. تصف هذه الورقة تضخيم الإشريكية القولونية والكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أنظمة CF-PCR و CE ، وكلاهما مدمج داخليا. تم تضخيم الجين المستهدف من الإشريكية القولونية بنجاح في غضون 10 دقائق بسبب ارتفاع ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل لجنة العلوم والتكنولوجيا التابعة لبلدية شنغهاي ، الصين (رقم 19ZR1477500 ورقم 18441900400). نعترف بامتنان بالدعم المالي من جامعة شنغهاي للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2017KJFZ049).
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Riferimenti
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
