Amplificatie van Escherichia coli in een Continuous-Flow-PCR microfluïdische chip en de detectie ervan met een capillair elektroforesesysteem
Summary
Dit protocol beschrijft hoe je een continuous-flow-polymeraseketensysteem bouwt op basis van een microfluïdische chip en hoe je een capillair elektroforesesysteem bouwt in het lab. Het presenteert een eenvoudige methode voor de analyse van nucleïnezuren in het laboratorium.
Abstract
Polymerasekettingreactie (PCR) is een traditionele methode die wordt gebruikt voor de amplificatie van een doelgen dat een belangrijke rol heeft gespeeld in de biomoleculaire diagnostiek. Traditionele PCR is echter zeer tijdrovend vanwege de variatie-efficiëntie bij lage temperaturen. Dit werk stelt een continuous-flow-PCR (CF-PCR) systeem voor op basis van een microfluïdische chip. De versterkingstijd kan aanzienlijk worden verkort door de PCR-oplossing in een microkanaal te laten lopen dat op verwarmers is geplaatst die op verschillende temperaturen zijn ingesteld. Omdat capillaire elektroforese (CE) een ideale manier is om positieve en vals-positieve PCR-producten te onderscheiden, werd bovendien een CE-systeem gebouwd om een efficiënte scheiding van de DNA-fragmenten te bereiken. Dit artikel beschrijft het proces van amplificatie van Escherichia coli (E. coli) door het in eigen huis gebouwde CF-PCR-systeem en de detectie van de PCR-producten door CE. De resultaten tonen aan dat het doelgen van E. coli binnen 10 minuten met succes werd geamplificeerd, wat aangeeft dat deze twee systemen kunnen worden gebruikt voor de snelle amplificatie en detectie van nucleïnezuren.
Introduction
Polymerasekettingreactie (PCR) is een moleculair-biologische techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-fragmenten te amplificeren, waardoor sporen van DNA honderden miljoenen keren worden versterkt. Het wordt veel gebruikt in klinische diagnose, medisch onderzoek, voedselveiligheid, forensische identificatie en andere gebieden. Het PCR-proces bestaat voornamelijk uit drie stappen: denaturatie bij 90-95 °C, gloeien bij 50-60 °C en extensie bij 72-77 °C. Thermische cycli zijn een belangrijk onderdeel van het PCR-proces; de traditionele PCR thermische cycler is echter niet alleen omvangrijk, maar ook inefficiënt, en heeft ongeveer 40 minuten nodig om 25 cycli te voltooien. Om deze beperkingen te ondervangen, werd in eigen huis een continuous-flow PCR (CF-PCR) systeem gebouwd, gebaseerd op een microfluïdische chip. CF-PCR kan veel tijd besparen door de PCR-oplossing in microkanalen te drijven die op verwarmers bij verschillende temperaturen zijn geplaatst: 1,2,3,4,5.
Omdat capillaire elektroforese (CE) veel voordelen heeft, zoals hoge resolutie, hoge snelheid en uitstekende reproduceerbaarheid 6,7,8,9,10,11, is het een populair hulpmiddel in het laboratorium geworden voor de analyse van nucleïnezuren en eiwitten. De meeste laboratoria, vooral laboratoria in ontwikkelingslanden, kunnen zich deze technologie echter niet veroorloven vanwege de hoge prijs van het CE-instrument. Hierin hebben we protocollen geschetst voor het fabriceren van de CF-PCR microfluïdische chip en het bouwen van een veelzijdig CE-systeem in het laboratorium. We demonstreren ook het proces van amplificatie van E. coli door dit CF-PCR-systeem en de detectie van de PCR-producten door het CE-systeem. Door de procedures te volgen die in dit protocol worden beschreven, zouden gebruikers in staat moeten zijn om microfluïdische chips te fabriceren, PCR-oplossingen te bereiden, een CF-PCR-systeem voor nucleïnezuuramplificatie te bouwen en een eenvoudig CE-systeem op te zetten, zelfs met beperkte middelen, om DNA-fragmenten te scheiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zowel PCR als CE zijn twee populaire biotechnologieën bij de analyse van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft de amplificatie van E. coli en de detectie van de PCR-producten met behulp van de CF-PCR- en CE-systemen, beide in eigen huis gebouwd. Het doelgen van E. coli werd binnen 10 minuten met succes geamplificeerd vanwege de hoge warmteoverdrachtssnelheden. De DNA-fragmenten kleiner dan 1.500 bp werden binnen 8 minuten gescheiden (Figuur 5). Het grote voordeel van deze…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Science and Technology Commission van de gemeente Shanghai, China (nr. 19ZR1477500 en nr. 18441900400). We zijn dankbaar voor de financiële steun van de Universiteit van Shanghai voor Wetenschap en Technologie (nr. 2017KJFZ049).
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Riferimenti
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
