הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד של מיקרו-רנ”א מבלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות. זהו הליך אוניברסלי המשלב ריאגנטים ואספקה נפוצים. השיטה גם מאפשרת שימוש במספר קטן של קרציות, וכתוצאה מכך מיקרו-רנ”א איכותיים שניתן לרצף בקלות.
קרציות הן ectoparasitesites חשוב שיכולים וקטור פתוגנים מרובים. בלוטות הרוק של הקרציות חיוניות להאכלה מכיוון שהרוק שלהן מכיל אפקטים רבים בעלי תכונות פרמצבטיות שיכולות להפחית את התגובה החיסונית של המארח ולהגביר את העברת הפתוגנים. קבוצה אחת של משפיעים כאלה הם מיקרו-רנ”א (miRNAs). miRNAs הם רצפים קצרים שאינם מקודדים המווסתים את ביטוי הגנים המארחים בממשק הקרצייה-מארח ובתוך איברי הקרצייה. רנ”א קטנים אלה מועברים ברוק הקרציות באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), המשרתות תקשורת בין-תאית ותוך-תאית. שלפוחיות המכילות miRNA זוהו ברוק של קרציות. עם זאת, מעט ידוע על התפקידים והפרופילים של miRNAs בשלפוחיות ובלוטות רוק קרציות. יתר על כן, המחקר של שלפוחיות ו miRNAs ברוק קרציות דורש הליכים מייגעים כדי לאסוף רוק קרציות. פרוטוקול זה נועד לפתח ולאמת שיטה לבידוד miRNAs מבועיות חוץ-תאיות מטוהרות המיוצרות על ידי תרביות איברים ex vivo . החומרים והמתודולוגיה הדרושים לחילוץ miRNA מבועיות חוץ-תאיות ומבלוטות רוק קרציות מתוארים כאן.
קרציות הן ectoparasitesites אשר וקטור פתוגנים רבים לחיות בר, בעלי חיים, בני אדם, וחיות המחמד שלהם 1,2. האכלת קרציות גורמת לאובדן כלכלי משמעותי על ידי גרימת נזק להסתרה, הפחתת המשקל וייצור החלב עקב אנמיה קשה, והעברת פתוגנים שעלולים לגרום למחלות קטלניות 1,3,4,5. נוהלי הבקרה הנוכחיים לניהול אוכלוסיות קרציות מתמקדים בשימוש בקוטלי אקריות. אף על פי כן, הופעתה המתמשכת של עמידות בפני קוטלים בקרציות הטפילות בעלי חיים 5,6, השכיחות המוגברת של עקיצות קרציות7 והעברת פתוגנים באזורי מגורים 8,9, הובילו לצורך בחלופות ייחודיות לבקרת קרציות.
בלוטות הרוק של הקרצייה הן איברים חיוניים המבטיחים את הצלחתה הביולוגית של הקרצייה. הם נוצרים על ידי סוגים שונים של צינוס (I, II, III ו- IV) עם פונקציות פיזיולוגיות שונות. בלוטות הרוק אחראיות לאוסמורגולציה, הן מחוץ לפונדקאי והן על הפונדקאי, על ידי החזרת עודף מים ותכולת ברזל לפונדקאי באמצעות ריר 2,10. אצ’יני מסוג I מעורבים גם בקליטת מים מהאטמוספרה על ידי הפרשת הרוק ההיגרוסקופי10,11. חלבונים משפיעי רוק, כגון מלט וציסטאטינים, מיוצרים בתוך תאים מפרישים בסוג II ו-IIIacini 10,12. אצ’יני מסוג I אינו משפיע על האכלת קרציות, מה שמצביע על כך שצריכת קמח הדם אינה מעוררת שינויים מורפולוגיים ופיזיולוגיים באצ’יני מסוג13,14 אלה. מצד שני, אצ’יני מסוג II ו- III מופעלים במהלך ההאכלה ומציגים מעט מאוד פעילות לפני ההתקשרות. לפיכך, האכלה נחוצה כדי להפעיל את הגדלת התאים המפרישים בתוך סוג II acini ואת הייצור של תרכובות ביואקטיביות. אצ’יני מסוג III מצטמצמים בגודלם במהלך ההאכלה עקב הפרשה בתוך גרגירי הפרשה12.
בלוטות הרוק הן גם האתר של זיהום פתוגן בקרצייה ובנתיב ההעברה. במהלך ההאכלה, הקרציות מפרישות מספר תרכובות עם השפעות תרופתיות הדרושות לסיום מוצלח של קמח הדם 10,15,16. לתרכובות אלה יש תכונות אנטי דלקתיות, מדכאות חיסון ואסודילטוריות 10,15,17. מחקרים אחרונים הראו כי שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המופקות מבלוטות הרוק של הקרציות מכילות כמה מהתרכובות הללו, מה שגורם להשפעות אנטי-דלקתיות ואימונו-אפנון 18,19,20. “שלפוחיות חוץ-תאיות” הוא מונח-על המשמש לתיאור בועיות המסווגות כאקסוזומים ומיקרו-ווסיקלים בהתבסס על גודלן ועל פי הביוגנזה שלהן. בסך הכל, כלי רכב חשמליים הם גושים שומניים עם ממברנות דו-שכבתיות שגודלן כ-40 ננומטר-1 מיקרומטר בגודל21; באופן כללי, אקסוזומים מתוארים כגודלם 40-150 ננומטר, בעוד שגודלם בין 150 ננומטר ל-1 מיקרומטר הוא 21,22,23. עם זאת, הגודל אינו מעיד על מסלול הביוגנזה של כלי הרכב החשמליים22.
הביוגנזה של האקסוזומים מתחילה באינווגינציה רציפה של קרום הפלזמה. אינווגינציה זו מובילה להיווצרותם של גופים רב-ווסקולריים ולבסוף גורמת לעיוות של קרום השלפוחית על ידי פעולה של קומפלקסים ESCRT או sphingomyelinases (sMases)24,25. ניתן לשכב את האקסוזומים בתוך הליזוזומים כדי לשמור על הומאוסטזיס תאי או לצאת באמצעות היתוך שלפוחיתי לקרום הפלזמה כדי להעביר מרכיבים תאיים לתאים המקבלים21,24. מצד שני, microvesicles נוצרים על ידי פעולה של flopasses ו flipasses, שינוי הקונפורמציה של שומנים בקרום פלזמה26. כלי רכב חשמליים חיוניים לתקשורת בין תאים, ומשמשים כמערכת הובלה למטענים תוך-תאיים, כגון שומנים, חלבונים, חומצות גרעין ומיקרו-רנ”א (miRNA)21,27,28. לאחר ההובלה, בועיות אלה מעבירות את המטען שלהן לתוך הציטופלסמה של התאים המקבלים, ויוצרות שינויים פנוטיפיים בתא המקבל22,29. בשל החשיבות של שלפוחיות חוץ-תאיות בהאכלת קרציות ומניפולציה של תגובות ריפוי חיסון ופצעים של המארח18,20, המטען בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות מציג מטרות פוטנציאליות לפיתוח טיפולים נגד קרציות ומנגנון ייחודי לשיבוש האכלת הקרציות. זה כולל miRNAs בתוך בלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בבלוטת הרוק.
miRNAs הם רצפים קצרים שאינם מקודדים, באורך של כ-18-22 נוקלאוטידים (nt), שיכולים לווסת, להשפיל או להשתיק רצפי mRNA לאחר שעתוק30,31. במהלך שעתוק, ה-pri-miRNAs נבקעים על ידי Dicer (RNA פולימראז III) ויוצרים מבנה ייחודי דמוי סיכת שיער, והופכים ל-pre-miRNA. הקדם-miRNA נחתך שוב על ידי Drosha (RNA פולימראז III) כדי ליצור דופלקס miRNA בוגר. הרצף הבוגר משתלב בקומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA (RISC) המשלים את רצף ה-mRNA, וגורם להדחקת תרגום או לפירוק mRNA 28,30,32. במהלך האכלת הפונדקאי, miRNAs בתוך רוק הקרציות יכולים לווסת את ביטוי הגנים המארחים כדי לדכא תגובות חיסוניות ולהגביר את העברת הפתוגנים ל-33,34,35,36,37. למרות שקיימים מחקרים מקיפים על כלי רכב חשמליים ו-miRNA, תפקידם במהלך ההזנה בממשק הטיק-מארח עדיין לא מובן היטב. אופטימיזציה של פרוטוקולים שיכולים בקלות לגרום לבידוד וטיהור של miRNA באיכות גבוהה היא חיונית לקידום הידע שלנו בנושאים אלה.
ניתן להשתמש באפשרויות רבות כדי לבודד כלי רכב חשמליים, כגון אולטרה-צנטריפוגציה, משקעים אקסוזומים, משקעים פולימריים, כרומטוגרפיה של אימונו-אפיניטי וטכניקות הרחקה מבוססות גודל38. עם זאת, טכניקות אלה אינן יכולות להבחין בין אקסוזומים או מיקרו-וסיקלים. לפיכך, כאמור, EV משמש כמונח מטריה בעת בידוד כלי רכב חשמליים מדגימות שונות. הבועיות שבודדו בניסויים המתוארים כאן מייצגות תערובת של שלפוחיות שמקורן במסלולי ביוגנזה שונים. טיהור נוסף של אוכלוסייה מסוימת של בועיות חוץ-תאיות יכול להיות מושג על ידי מיצוי חיסוני באמצעות חרוזים המצופים בנוגדנים נגד סמנים (כלומר, סמנים אקסוזומליים, סמני גידול) הייחודיים לאוכלוסיית השלפוחית המעניינת39,40. ניתן גם לחלץ miRNAs באמצעות ערכות בידוד שונות הזמינות מסחרית 7,41,42.
מטרת הפרויקט הייתה לפתח פרוטוקול המשלב שיטות נפוצות לבידוד כלי רכב חשמליים ולמיצוי miRNA הן מרכבים חשמליים והן מבלוטות רוק מוזנות. מאחר שהפרשת תרכובות ביו-אקטיביות מופעלת על-ידי האכלהשל 12, יש לאפשר לקרציות להזין כדי לזהות miRNAs שעשויים להיות חשובים למניפולציה של תגובות חיסוניות ופצעים של פונדקאי. הפרוטוקול הנוכחי דורש מספר קטן של קרציות (20 קרציות) כדי לבודד כלי רכב חשמליים ואת ה-miRNA שלהם בהתאמה, בהשוואה למחקרים אחרים שתוארו קודם לכן שדרשו 2000 קרציות43. יתר על כן, הוא מונע זיהום של הפרשות רוק עם pilocarpine44, אשר יכול להשפיע על ניסויים החוקרים את ההשפעה של כלי רכב חשמליים ואת miRNAs שלהם על תאים מארחים.
הפרוטוקול הנוכחי מספק מתודולוגיה מפורטת לחילוץ miRNA מבלוטות הרוק ומרכבים חשמליים. עם זאת, ישנם שיקולים חשובים, שכולם מפורטים בהערות עבור כל סעיף בפרוטוקול זה. יש לאבטח את הקפסולה ואת רשת הרשת במהלך האכלת הקרציות כדי למנוע מהקרציות לברוח. ההכנה והמיקום של הקפסולה מתוארים ב- Koga et al.40…
The authors have nothing to disclose.
אנו מעריכים מאוד את הסיוע ממעבדת קרציות קדחת הבקר באדינבורו, טקסס. ברצוננו להודות למייקל מוזס, ג’ייסון טידוול, ג’יימס הלומס, סזאריו אגאדו והומר ואסקז. ברצוננו גם להודות על עזרתן של שרה שרפטון, אליזבת לוהסטרו, איימי פיליפ, קלסי ג’ונסון, קלי קוצ’קאן, אנדרו הילאוס, צ’רלוז ארוצ’ו רוסאריו וסטפני גוזמן ולנסיה לאורך כל הפרויקט. ברצוננו להודות לקבוצת הכתיבה של טקסס A&M Aggie Women in Entomology (AWE) על עזרתן ועצותיהן במהלך כתיבת כתב יד זה. הריאגנטים הבאים סופקו על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן להפצה על ידי משאבי BEI, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (חי), NR-42510. נקבות קרציות I. scapularis התקבלו גם הן ממתקן גידול הקרציות באוניברסיטת אוקלהומה סטייט. פרויקט זה מומן על ידי אוניברסיטת טקסס A&M T3: שלישיות למענק טרנספורמציה והסכם שיתוף הפעולה #58-3094-1-003 על ידי USDA-ARS ל- AOC.
0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
Chloroform | Macron | UN1888 | |
Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
L15C300 medium | In-lab | ||
lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
Pippettes | Ependorff | ||
polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
Rabbits | Charles River | ||
Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
TapeStation | Aligent | G2991BA | |
Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |