Выделение микроРНК из клещей Ex vivo Культуры слюнных желез и внеклеточных везикул
Summary
Настоящий протокол описывает выделение микроРНК из клещевых слюнных желез и очищенных внеклеточных везикул. Это универсальная процедура, которая сочетает в себе широко используемые реагенты и расходные материалы. Метод также позволяет использовать небольшое количество клещей, что приводит к качественным микроРНК, которые могут быть легко секвенированы.
Abstract
Клещи являются важными эктопаразитами, которые могут переносить несколько патогенов. Слюнные железы клещей необходимы для кормления, поскольку их слюна содержит много эффекторов с фармацевтическими свойствами, которые могут уменьшить иммунные реакции хозяина и усилить передачу патогенов. Одной из групп таких эффекторов являются микроРНК (миРНК). miRNAs представляют собой короткие некодирующие последовательности, которые регулируют экспрессию генов хозяина на границе клеща и хозяина и в органах клеща. Эти небольшие РНК транспортируются в слюне клеща через внеклеточные везикулы (EV), которые служат меж- и внутриклеточной связи. Везикулы, содержащие микроРНК, были идентифицированы в слюне клещей. Тем не менее, мало что известно о роли и профилях микроРНК в пузырьках и железах слюны клещей. Кроме того, изучение везикул и миРНК в слюне клещей требует утомительных процедур по сбору слюны клещей. Этот протокол направлен на разработку и валидацию метода выделения миРНК из очищенных внеклеточных везикул, продуцируемых культурами органов ex vivo . Материалы и методология, необходимые для извлечения миРНК из внеклеточных пузырьков и клещевых слюнных желез, описаны в настоящем описании.
Introduction
Клещи — это эктопаразиты, которые переносят многие патогены в дикую природу, домашний скот, людей и их домашних животных 1,2. Кормление клещей приводит к значительным экономическим потерям, вызывая повреждение шкуры, снижая вес и производство молока из-за тяжелой анемии и передачу потенциально смертельных болезнетворных патогенов 1,3,4,5. Современные методы контроля для управления популяциями клещей сосредоточены на использовании акарицидов. Тем не менее, непрерывное появление устойчивости к акарицидам у клещей, паразитирующих на поголовье 5,6, увеличение числа укусов клещей7 и передача патогенов в жилых районах 8,9 привели к необходимости уникальных альтернатив борьбы с клещами.
Клещевые слюнные железы являются важными органами, которые обеспечивают биологический успех клеща. Они образованы различными типами ацинуса (I, II, III и IV) с различными физиологическими функциями. Слюнные железы отвечают за осморегуляцию, как вне, так и на хозяине, возвращая избыток воды и содержание железа хозяину через слюноотделение 2,10. Ацины I типа также участвуют в поглощении воды из атмосферы путем секреции гигроскопичной слюны10,11. Слюнные эффекторные белки, такие как цемент и цистатины, продуцируются в секреторных клетках в ацинусах II и III типа10,12. Ацины I типа не влияют на кормление клещей, что указывает на то, что прием в кровь не вызывает морфологических и физиологических изменений в этих ацинах типа13,14. С другой стороны, Acini типа II и III активируются во время кормления и проявляют очень небольшую активность до прикрепления. Таким образом, кормление необходимо для того, чтобы вызвать увеличение секреторных клеток в пределах ацинов II типа и выработку биологически активных соединений. Ацины III типа уменьшаются в размерах во время кормления из-за секреции внутри секреторных гранул12.
Слюнные железы также являются местом патогенной инфекции в клеще и пути передачи. Во время кормления клещи выделяют несколько соединений с фармацевтическим эффектом, которые необходимы для успешного завершения кровяноймуки 10,15,16. Эти соединения обладают противовоспалительными, иммуносупрессивными и сосудорасширяющими свойствами 10,15,17. Недавние исследования показали, что внеклеточные везикулы (EV), полученные из клещевых слюнных желез, содержат несколько из этих соединений, вызывая противовоспалительные и иммуномодулирующие эффекты 18,19,20. «Внеклеточные везикулы» – это общий термин, используемый для описания везикул, классифицируемых как экзосомы и микровезикулы на основе их размера и биогенеза. В целом, EV представляют собой липидные блебы с двухслойными мембранами, которые составляют ~ 40 нм-1 мкм в размере21; как правило, экзосомы описываются как имеющие размер 40-150 нм, тогда как микровезикулы имеют размер от 150 нм до 1 мкм 21,22,23. Однако размер не указывает на путь биогенеза EV22.
Биогенез экзосом начинается с последовательной инвагинации плазматической мембраны. Эта инвагинация приводит к образованию мультивезикулярных тел и в конечном итоге приводит к деформации везикулярной мембраны под действием комплексов ESCRT или сфингомиелиназ (sMases)24,25. Экзосомы могут либо лизироваться внутри лизосом для поддержания клеточного гомеостаза, либо выходить через везикулярное слияние с плазматической мембраной для доставки клеточных компонентов к клеткам-реципиентам21,24. С другой стороны, микровезикулы образуются под действием флоапсов и флипсов, изменяя конформацию липидов в плазматической мембране26. EV необходимы для межклеточной связи, служа транспортной системой для внутриклеточных грузов, таких как липиды, белки, нуклеиновые кислоты и микроРНК (миРНК)21,27,28. После транспортировки эти везикулы доставляют свой груз в цитоплазму клеток-реципиентов, вызывая фенотипические изменения в принимающей клетке22,29. Из-за важности внеклеточных везикул в кормлении клещей и манипулирования иммунными и ранозаживляющими реакциями хозяина18,20, груз во внеклеточных везикулах представляет собой потенциальные цели для разработки антиклещевых терапевтических средств и уникального механизма для нарушения кормления клещей. Это включает в себя микроРНК в клещевых слюнных железах и внеклеточных везикулах, полученных из слюнных желез.
миРНК представляют собой короткие некодирующие последовательности, длиной ~ 18-22 нуклеотида (nt), которые могут посттранскрипционно регулировать, ухудшать или заглушать последовательности мРНК30,31. Во время транскрипции примиРНК расщепляются Dicer (РНК-полимераза III) с образованием отличительной шпилькообразной структуры, становясь премирнкальной РНК. ПремиРНК снова разрезается Дрошей (РНК-полимеразой III) с образованием зрелого дуплекса миРНК. Зрелая последовательность интегрируется в РНК-индуцированный комплекс глушения (RISC), комплементарный последовательности мРНК, вызывая подавление трансляции или деградацию мРНК 28,30,32. Во время кормления хозяина миРНК в слюне клеща могут модулировать экспрессию гена хозяина для подавления иммунных реакций иусиления передачи патогена 33,34,35,36,37. Хотя существуют обширные исследования ev и miRNAs, их роль во время кормления на интерфейсе клещ-хозяин все еще плохо изучена. Оптимизация протоколов, которые могут легко привести к изоляции и очистке высококачественных микроРНК, имеет решающее значение для продвижения наших знаний по этим темам.
Для выделения электромобилей могут быть использованы несколько вариантов, таких как ультрацентрифугирование, осаждение экзосом, осаждение полимеров, иммуноаффинная хроматография и методы исключения на основе размера38. Однако эти методы не могут различать экзосомы или микровезикулы. Таким образом, как упоминалось ранее, EV используется в качестве зонтичного термина при выделении электромобилей из разных образцов. Везикулы, выделенные в экспериментах, описанных в настоящем описании, представляют собой смесь везикул, полученных из различных путей биогенеза. Дальнейшая очистка специфической популяции внеклеточных везикул может быть достигнута путем иммунопреципитации с использованием шариков, покрытых антителами против маркеров (т.е. экзосомальных маркеров, опухолевых маркеров), уникальных для везикул, представляющих интерес39,40. miRNAs также могут быть извлечены с помощью различных коммерчески доступных изоляционных наборов 7,41,42.
Цель этого проекта состояла в том, чтобы разработать протокол, который сочетает в себе широко применяемые методы выделения EV и извлечения миРНК как из EV, так и из слюнных желез. Поскольку секреция биологически активных соединений активируется при кормлении12, клещам следует разрешить питаться для выявления миРНК, которые могут быть важны для манипулирования иммунными реакциями хозяина и заживления ран. Настоящий протокол требует небольшого количества клещей (20 клещей) для изоляции EV и их соответствующих микроРНК по сравнению с другими ранее описанными исследованиями, которые требовали 2000 тиков43. Кроме того, он позволяет избежать загрязнения секреции слюны пилокарпином44, что может повлиять на эксперименты, изучающие влияние EV и их миРНК на клетки-хозяева.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий протокол предоставляет подробную методологию извлечения миРНК из слюнных желез и EV. Однако существуют важные соображения, все из которых подробно изложены в примечаниях к каждому разделу этого протокола. Капсула и сетка должны быть закреплены во время кормления клещей, чтобы ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы очень признательны за помощь лаборатории клещей лихорадки крупного рогатого скота в Эдинбурге, штат Техас. Мы хотели бы поблагодарить Майкла Мозеса, Джейсона Тидуэлла, Джеймса Хеллумса, Сезарио Агадо и Гомера Васкеса. Мы также хотели бы отметить помощь Сары Шарптон, Элизабет Лостро, Эми Филип, Келси Джонсон, Келли Кохкан, Эндрю Хиллхауса, Шарлуса Арочо Росарио и Стефани Гусман Валенсия на протяжении всего проекта. Мы хотели бы поблагодарить Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group за помощь и советы во время написания этой рукописи. Следующие реагенты были предоставлены Центрами по контролю и профилактике заболеваний для распространения BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Самки клещей I. scapularis также были получены из Центра выращивания клещей в Университете штата Оклахома. Этот проект был профинансирован Техасским университетом A & M T3: триады для гранта на трансформацию и соглашение о сотрудничестве No 58-3094-1-003 USDA-ARS для AOC.
Materials
| 0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
| 1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
| 1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
| 10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
| 3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| 4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
| 70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
| Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
| Chloroform | Macron | UN1888 | |
| Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
| Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
| fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
| Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
| Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
| L15C300 medium | In-lab | ||
| lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
| Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
| miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
| M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
| multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
| Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
| Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
| NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
| Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
| Pippettes | Ependorff | ||
| polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
| Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
| QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
| Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
| Rabbits | Charles River | ||
| Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
| Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
| RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
| RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
| RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
| RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
| Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
| Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
| streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
| TapeStation | Aligent | G2991BA | |
| Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
| Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
| Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
| Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |
Riferimenti
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129, 3-14 (2004).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).
- de la Fuente, J. Controlling ticks and tick-borne diseases… looking forward. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1354-1357 (2018).
- Nicholson, W. L., Sonenshine, D. E., Noden, B. H., Brown, R. N. Ticks (Ixodia). Medical and Veterinary Entomology. , 603-672 (2019).
- Guerrero, F. D., Lovis, L., Martins, J. R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 21 (1), 1-6 (2012).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: the state of play. Veterinary Parasitology. 203 (1-2), 6-20 (2014).
- Redshaw, N., et al. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability. Biotechniques. 54 (3), 155-164 (2013).
- Estrada-Peña, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Experimental and Applied Acarology. 23 (9), 685-715 (1999).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: an increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Bowman, A. S., Sauer, J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 129, 67 (2004).
- Kim, D., Maldonado-Ruiz, P., Zurek, L., Park, Y. Water absorption through salivary gland type I acini in the blacklegged tick, Ixodes scapularis. PeerJ. 5, 3984 (2017).
- Nunes, P. H., Bechara, G. H., Camargo-Mathias, M. I. Morphological changes in the salivary glands of Amblyomma cajennense females (Acari: Ixodidae) in different feeding stages on rabbits at first infestation. Experimental and Applied Acarology. 45 (3), 199-209 (2008).
- Bishop, R., et al. A cement protein of the tick Rhipicephalusappendiculatus, located in the secretory e cell granules of the type III salivary gland acini, induces strong antibody responses in cattle. International Journal for Parasitology. 32 (7), 833-842 (2002).
- Yamaji, K., et al. A salivary cystatin, HlSC-1, from the ixodid tick Haemaphysalis longicornis play roles in the blood-feeding processes. Parasitology Research. 106 (1), 61-68 (2009).
- Simo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 281 (2017).
- Perner, J., Kropáčková, S., Kopáček, P., Ribeiro, J. M. C. Sialome diversity of ticks revealed by RNAseq of single tick salivary glands. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), 0006410 (2018).
- Madden, R. D., Sauer, J. R., Dillwith, J. W. A proteomics approach to characterizing tick salivary secretions. Experimental and Applied Acarology. 32 (1), 131-141 (2004).
- Zhou, W., et al. Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick-human skin interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 554 (2020).
- Zhou, W., et al. Exosomes serve as novel modes of tick-borne flavivirus transmission from arthropod to human cells and facilitates dissemination of viral RNA and proteins to the vertebrate neuronal cells. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006764 (2018).
- Chávez, A. S. O., et al. Tick extracellular vesicles enable arthropod feeding and promote distinct outcomes of bacterial infection. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213 (2018).
- Gioseffi, A., Edelmann, M. J., Kima, P. E. Intravacuolar pathogens hijack host extracellular vesicle biogenesis to secrete virulence factors. Frontiers in Immunology. 12, 662944 (2021).
- Chávez, A. S. O., O’Neal, A. J., Santambrogio, L., Kotsyfakis, M., Pedra, J. H. F. Message in a vesicle-trans-kingdom intercommunication at the vector-host interface. Journal of Cell Science. 132 (6), 224212 (2019).
- Janas, T., Janas, M. M., Sapoń, K., Janas, T. Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS Letters. 589 (13), 1391-1398 (2015).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
- Pegtel, D. M., et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (14), 6328-6333 (2010).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Ambros, V. MicroRNAs and developmental timing. Current Opinion in Genetics and Development. 21 (4), 511-517 (2011).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Hackenberg, M., Langenberger, D., Schwarz, A., Erhart, J., Kotsyfakis, M. In silico target network analysis of de novo-discovered, tick saliva-specific microRNAs reveals important combinatorial effects in their interference with vertebrate host physiology. RNA. 23 (8), 1259-1269 (2017).
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 promotes the development of and prolongs engorgement time in Hyalomma anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) ticks. Biorxiv. , (2020).
- Zhou, J., Zhou, Y., Cao, J., Zhang, H., Yu, Y. Distinctive microRNA profiles in the salivary glands of Haemaphysalis longicornis related to tick blood-feeding. Experimental and Applied Acarology. 59 (3), 339-349 (2013).
- Hermance, M. E., Widen, S. G., Wood, T. G., Thangamani, S. Ixodes scapularis salivary gland microRNAs are differentially expressed during Powassan virus transmission. Scientific Reports. 9 (1), 1-17 (2019).
- Barrero, R. A., et al. Evolutionary conserved microRNAs are ubiquitously expressed compared to tick-specific miRNAs in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics. 12 (1), 1-17 (2011).
- Colombo, M., et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. Journal of Cell Science. 126 (24), 5553-5565 (2013).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. . Proteomic Profiling. , 179-209 (2015).
- Koga, K., et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Research. 25, 3703-3707 (2005).
- Wright, K., de Silva, K., Purdie, A. C., Plain, K. M. Comparison of methods for miRNA isolation and quantification from ovine plasma. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
- Mráz, M., Malinova, K., Mayer, J., Pospisilova, S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (1), 1-4 (2009).
- Nawaz, M., et al. miRNA profile of extracellular vesicles isolated from saliva of Haemaphysalis longicornis tick. Acta Tropica. 212, 105718 (2020).
- Ribeiro, J. M. C., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva. Medical and Veterinary Entomology. 18 (1), 20-24 (2004).
- Almazán, C., et al. A versatile model of hard tick infestation on laboratory rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Masotti, A., Preckel, T. Analysis of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer. Nature Methods. 3 (8), 658 (2006).
- Benesova, S., Kubista, M., Valihrach, L. Small RNA-sequencing: approaches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics. 11 (6), 964 (2021).
- Mackowiak, S. D. Identification of novel and known miRNAs in deep-sequencing data with miRDeep2. Current Protocols in Bioinformatics. 36 (1), 12 (2011).
- Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research. 40 (1), 37-52 (2012).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA registry. Nucleic Acids Research. 32, 109-111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, 140-144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2007).
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47, 155-162 (2019).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, 152-157 (2011).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
- Wu, F., et al. MicroRNA let-7 regulates the expression of ecdysteroid receptor (ECR) in Hyalomma asiaticum (Acari: Ixodidae) ticks. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-13 (2019).
- Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science. 2, 34 (2011).
- Merchant, N., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for enabling data to discovery for the life sciences. PLoS Biology. 14 (1), 1002342 (2016).
- Kumar, D., et al. An exploratory study on the microbiome of northern and southern populations of Ixodes scapularis ticks predicts changes and unique bacterial interactions. Pathogens. 11 (2), 130 (2022).
- Zhang, Y., et al. Exosome: a review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917 (2020).
- Di Leva, G., Croce, C. M. miRNA profiling of cancer. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (1), 3-11 (2013).
- Ganju, A., et al. miRNA nanotherapeutics for cancer. Drug Discovery Today. 22 (2), 424-432 (2017).
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 Expression and Function in Hyalomma Anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) Ticks. Frontiers in Physiology. 12, 596289 (2021).
