בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד של מיקרו-רנ”א מבלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות. זהו הליך אוניברסלי המשלב ריאגנטים ואספקה נפוצים. השיטה גם מאפשרת שימוש במספר קטן של קרציות, וכתוצאה מכך מיקרו-רנ”א איכותיים שניתן לרצף בקלות.
Abstract
קרציות הן ectoparasitesites חשוב שיכולים וקטור פתוגנים מרובים. בלוטות הרוק של הקרציות חיוניות להאכלה מכיוון שהרוק שלהן מכיל אפקטים רבים בעלי תכונות פרמצבטיות שיכולות להפחית את התגובה החיסונית של המארח ולהגביר את העברת הפתוגנים. קבוצה אחת של משפיעים כאלה הם מיקרו-רנ”א (miRNAs). miRNAs הם רצפים קצרים שאינם מקודדים המווסתים את ביטוי הגנים המארחים בממשק הקרצייה-מארח ובתוך איברי הקרצייה. רנ”א קטנים אלה מועברים ברוק הקרציות באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), המשרתות תקשורת בין-תאית ותוך-תאית. שלפוחיות המכילות miRNA זוהו ברוק של קרציות. עם זאת, מעט ידוע על התפקידים והפרופילים של miRNAs בשלפוחיות ובלוטות רוק קרציות. יתר על כן, המחקר של שלפוחיות ו miRNAs ברוק קרציות דורש הליכים מייגעים כדי לאסוף רוק קרציות. פרוטוקול זה נועד לפתח ולאמת שיטה לבידוד miRNAs מבועיות חוץ-תאיות מטוהרות המיוצרות על ידי תרביות איברים ex vivo . החומרים והמתודולוגיה הדרושים לחילוץ miRNA מבועיות חוץ-תאיות ומבלוטות רוק קרציות מתוארים כאן.
Introduction
קרציות הן ectoparasitesites אשר וקטור פתוגנים רבים לחיות בר, בעלי חיים, בני אדם, וחיות המחמד שלהם 1,2. האכלת קרציות גורמת לאובדן כלכלי משמעותי על ידי גרימת נזק להסתרה, הפחתת המשקל וייצור החלב עקב אנמיה קשה, והעברת פתוגנים שעלולים לגרום למחלות קטלניות 1,3,4,5. נוהלי הבקרה הנוכחיים לניהול אוכלוסיות קרציות מתמקדים בשימוש בקוטלי אקריות. אף על פי כן, הופעתה המתמשכת של עמידות בפני קוטלים בקרציות הטפילות בעלי חיים 5,6, השכיחות המוגברת של עקיצות קרציות7 והעברת פתוגנים באזורי מגורים 8,9, הובילו לצורך בחלופות ייחודיות לבקרת קרציות.
בלוטות הרוק של הקרצייה הן איברים חיוניים המבטיחים את הצלחתה הביולוגית של הקרצייה. הם נוצרים על ידי סוגים שונים של צינוס (I, II, III ו- IV) עם פונקציות פיזיולוגיות שונות. בלוטות הרוק אחראיות לאוסמורגולציה, הן מחוץ לפונדקאי והן על הפונדקאי, על ידי החזרת עודף מים ותכולת ברזל לפונדקאי באמצעות ריר 2,10. אצ’יני מסוג I מעורבים גם בקליטת מים מהאטמוספרה על ידי הפרשת הרוק ההיגרוסקופי10,11. חלבונים משפיעי רוק, כגון מלט וציסטאטינים, מיוצרים בתוך תאים מפרישים בסוג II ו-IIIacini 10,12. אצ’יני מסוג I אינו משפיע על האכלת קרציות, מה שמצביע על כך שצריכת קמח הדם אינה מעוררת שינויים מורפולוגיים ופיזיולוגיים באצ’יני מסוג13,14 אלה. מצד שני, אצ’יני מסוג II ו- III מופעלים במהלך ההאכלה ומציגים מעט מאוד פעילות לפני ההתקשרות. לפיכך, האכלה נחוצה כדי להפעיל את הגדלת התאים המפרישים בתוך סוג II acini ואת הייצור של תרכובות ביואקטיביות. אצ’יני מסוג III מצטמצמים בגודלם במהלך ההאכלה עקב הפרשה בתוך גרגירי הפרשה12.
בלוטות הרוק הן גם האתר של זיהום פתוגן בקרצייה ובנתיב ההעברה. במהלך ההאכלה, הקרציות מפרישות מספר תרכובות עם השפעות תרופתיות הדרושות לסיום מוצלח של קמח הדם 10,15,16. לתרכובות אלה יש תכונות אנטי דלקתיות, מדכאות חיסון ואסודילטוריות 10,15,17. מחקרים אחרונים הראו כי שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המופקות מבלוטות הרוק של הקרציות מכילות כמה מהתרכובות הללו, מה שגורם להשפעות אנטי-דלקתיות ואימונו-אפנון 18,19,20. “שלפוחיות חוץ-תאיות” הוא מונח-על המשמש לתיאור בועיות המסווגות כאקסוזומים ומיקרו-ווסיקלים בהתבסס על גודלן ועל פי הביוגנזה שלהן. בסך הכל, כלי רכב חשמליים הם גושים שומניים עם ממברנות דו-שכבתיות שגודלן כ-40 ננומטר-1 מיקרומטר בגודל21; באופן כללי, אקסוזומים מתוארים כגודלם 40-150 ננומטר, בעוד שגודלם בין 150 ננומטר ל-1 מיקרומטר הוא 21,22,23. עם זאת, הגודל אינו מעיד על מסלול הביוגנזה של כלי הרכב החשמליים22.
הביוגנזה של האקסוזומים מתחילה באינווגינציה רציפה של קרום הפלזמה. אינווגינציה זו מובילה להיווצרותם של גופים רב-ווסקולריים ולבסוף גורמת לעיוות של קרום השלפוחית על ידי פעולה של קומפלקסים ESCRT או sphingomyelinases (sMases)24,25. ניתן לשכב את האקסוזומים בתוך הליזוזומים כדי לשמור על הומאוסטזיס תאי או לצאת באמצעות היתוך שלפוחיתי לקרום הפלזמה כדי להעביר מרכיבים תאיים לתאים המקבלים21,24. מצד שני, microvesicles נוצרים על ידי פעולה של flopasses ו flipasses, שינוי הקונפורמציה של שומנים בקרום פלזמה26. כלי רכב חשמליים חיוניים לתקשורת בין תאים, ומשמשים כמערכת הובלה למטענים תוך-תאיים, כגון שומנים, חלבונים, חומצות גרעין ומיקרו-רנ”א (miRNA)21,27,28. לאחר ההובלה, בועיות אלה מעבירות את המטען שלהן לתוך הציטופלסמה של התאים המקבלים, ויוצרות שינויים פנוטיפיים בתא המקבל22,29. בשל החשיבות של שלפוחיות חוץ-תאיות בהאכלת קרציות ומניפולציה של תגובות ריפוי חיסון ופצעים של המארח18,20, המטען בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות מציג מטרות פוטנציאליות לפיתוח טיפולים נגד קרציות ומנגנון ייחודי לשיבוש האכלת הקרציות. זה כולל miRNAs בתוך בלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בבלוטת הרוק.
miRNAs הם רצפים קצרים שאינם מקודדים, באורך של כ-18-22 נוקלאוטידים (nt), שיכולים לווסת, להשפיל או להשתיק רצפי mRNA לאחר שעתוק30,31. במהלך שעתוק, ה-pri-miRNAs נבקעים על ידי Dicer (RNA פולימראז III) ויוצרים מבנה ייחודי דמוי סיכת שיער, והופכים ל-pre-miRNA. הקדם-miRNA נחתך שוב על ידי Drosha (RNA פולימראז III) כדי ליצור דופלקס miRNA בוגר. הרצף הבוגר משתלב בקומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA (RISC) המשלים את רצף ה-mRNA, וגורם להדחקת תרגום או לפירוק mRNA 28,30,32. במהלך האכלת הפונדקאי, miRNAs בתוך רוק הקרציות יכולים לווסת את ביטוי הגנים המארחים כדי לדכא תגובות חיסוניות ולהגביר את העברת הפתוגנים ל-33,34,35,36,37. למרות שקיימים מחקרים מקיפים על כלי רכב חשמליים ו-miRNA, תפקידם במהלך ההזנה בממשק הטיק-מארח עדיין לא מובן היטב. אופטימיזציה של פרוטוקולים שיכולים בקלות לגרום לבידוד וטיהור של miRNA באיכות גבוהה היא חיונית לקידום הידע שלנו בנושאים אלה.
ניתן להשתמש באפשרויות רבות כדי לבודד כלי רכב חשמליים, כגון אולטרה-צנטריפוגציה, משקעים אקסוזומים, משקעים פולימריים, כרומטוגרפיה של אימונו-אפיניטי וטכניקות הרחקה מבוססות גודל38. עם זאת, טכניקות אלה אינן יכולות להבחין בין אקסוזומים או מיקרו-וסיקלים. לפיכך, כאמור, EV משמש כמונח מטריה בעת בידוד כלי רכב חשמליים מדגימות שונות. הבועיות שבודדו בניסויים המתוארים כאן מייצגות תערובת של שלפוחיות שמקורן במסלולי ביוגנזה שונים. טיהור נוסף של אוכלוסייה מסוימת של בועיות חוץ-תאיות יכול להיות מושג על ידי מיצוי חיסוני באמצעות חרוזים המצופים בנוגדנים נגד סמנים (כלומר, סמנים אקסוזומליים, סמני גידול) הייחודיים לאוכלוסיית השלפוחית המעניינת39,40. ניתן גם לחלץ miRNAs באמצעות ערכות בידוד שונות הזמינות מסחרית 7,41,42.
מטרת הפרויקט הייתה לפתח פרוטוקול המשלב שיטות נפוצות לבידוד כלי רכב חשמליים ולמיצוי miRNA הן מרכבים חשמליים והן מבלוטות רוק מוזנות. מאחר שהפרשת תרכובות ביו-אקטיביות מופעלת על-ידי האכלהשל 12, יש לאפשר לקרציות להזין כדי לזהות miRNAs שעשויים להיות חשובים למניפולציה של תגובות חיסוניות ופצעים של פונדקאי. הפרוטוקול הנוכחי דורש מספר קטן של קרציות (20 קרציות) כדי לבודד כלי רכב חשמליים ואת ה-miRNA שלהם בהתאמה, בהשוואה למחקרים אחרים שתוארו קודם לכן שדרשו 2000 קרציות43. יתר על כן, הוא מונע זיהום של הפרשות רוק עם pilocarpine44, אשר יכול להשפיע על ניסויים החוקרים את ההשפעה של כלי רכב חשמליים ואת miRNAs שלהם על תאים מארחים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מספק מתודולוגיה מפורטת לחילוץ miRNA מבלוטות הרוק ומרכבים חשמליים. עם זאת, ישנם שיקולים חשובים, שכולם מפורטים בהערות עבור כל סעיף בפרוטוקול זה. יש לאבטח את הקפסולה ואת רשת הרשת במהלך האכלת הקרציות כדי למנוע מהקרציות לברוח. ההכנה והמיקום של הקפסולה מתוארים ב- Koga et al.40…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים מאוד את הסיוע ממעבדת קרציות קדחת הבקר באדינבורו, טקסס. ברצוננו להודות למייקל מוזס, ג’ייסון טידוול, ג’יימס הלומס, סזאריו אגאדו והומר ואסקז. ברצוננו גם להודות על עזרתן של שרה שרפטון, אליזבת לוהסטרו, איימי פיליפ, קלסי ג’ונסון, קלי קוצ’קאן, אנדרו הילאוס, צ’רלוז ארוצ’ו רוסאריו וסטפני גוזמן ולנסיה לאורך כל הפרויקט. ברצוננו להודות לקבוצת הכתיבה של טקסס A&M Aggie Women in Entomology (AWE) על עזרתן ועצותיהן במהלך כתיבת כתב יד זה. הריאגנטים הבאים סופקו על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן להפצה על ידי משאבי BEI, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (חי), NR-42510. נקבות קרציות I. scapularis התקבלו גם הן ממתקן גידול הקרציות באוניברסיטת אוקלהומה סטייט. פרויקט זה מומן על ידי אוניברסיטת טקסס A&M T3: שלישיות למענק טרנספורמציה והסכם שיתוף הפעולה #58-3094-1-003 על ידי USDA-ARS ל- AOC.
Materials
| 0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
| 1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
| 1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
| 10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
| 3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| 4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
| 70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
| Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
| Chloroform | Macron | UN1888 | |
| Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
| Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
| fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
| Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
| Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
| L15C300 medium | In-lab | ||
| lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
| Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
| miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
| M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
| multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
| Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
| Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
| NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
| Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
| Pippettes | Ependorff | ||
| polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
| Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
| QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
| Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
| Rabbits | Charles River | ||
| Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
| Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
| RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
| RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
| RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
| RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
| Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
| Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
| streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
| TapeStation | Aligent | G2991BA | |
| Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
| Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
| Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
| Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |
Riferimenti
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129, 3-14 (2004).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).
- de la Fuente, J. Controlling ticks and tick-borne diseases… looking forward. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1354-1357 (2018).
- Nicholson, W. L., Sonenshine, D. E., Noden, B. H., Brown, R. N. Ticks (Ixodia). Medical and Veterinary Entomology. , 603-672 (2019).
- Guerrero, F. D., Lovis, L., Martins, J. R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 21 (1), 1-6 (2012).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: the state of play. Veterinary Parasitology. 203 (1-2), 6-20 (2014).
- Redshaw, N., et al. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability. Biotechniques. 54 (3), 155-164 (2013).
- Estrada-Peña, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Experimental and Applied Acarology. 23 (9), 685-715 (1999).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: an increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Bowman, A. S., Sauer, J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 129, 67 (2004).
- Kim, D., Maldonado-Ruiz, P., Zurek, L., Park, Y. Water absorption through salivary gland type I acini in the blacklegged tick, Ixodes scapularis. PeerJ. 5, 3984 (2017).
- Nunes, P. H., Bechara, G. H., Camargo-Mathias, M. I. Morphological changes in the salivary glands of Amblyomma cajennense females (Acari: Ixodidae) in different feeding stages on rabbits at first infestation. Experimental and Applied Acarology. 45 (3), 199-209 (2008).
- Bishop, R., et al. A cement protein of the tick Rhipicephalusappendiculatus, located in the secretory e cell granules of the type III salivary gland acini, induces strong antibody responses in cattle. International Journal for Parasitology. 32 (7), 833-842 (2002).
- Yamaji, K., et al. A salivary cystatin, HlSC-1, from the ixodid tick Haemaphysalis longicornis play roles in the blood-feeding processes. Parasitology Research. 106 (1), 61-68 (2009).
- Simo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 281 (2017).
- Perner, J., Kropáčková, S., Kopáček, P., Ribeiro, J. M. C. Sialome diversity of ticks revealed by RNAseq of single tick salivary glands. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), 0006410 (2018).
- Madden, R. D., Sauer, J. R., Dillwith, J. W. A proteomics approach to characterizing tick salivary secretions. Experimental and Applied Acarology. 32 (1), 131-141 (2004).
- Zhou, W., et al. Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick-human skin interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 554 (2020).
- Zhou, W., et al. Exosomes serve as novel modes of tick-borne flavivirus transmission from arthropod to human cells and facilitates dissemination of viral RNA and proteins to the vertebrate neuronal cells. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006764 (2018).
- Chávez, A. S. O., et al. Tick extracellular vesicles enable arthropod feeding and promote distinct outcomes of bacterial infection. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213 (2018).
- Gioseffi, A., Edelmann, M. J., Kima, P. E. Intravacuolar pathogens hijack host extracellular vesicle biogenesis to secrete virulence factors. Frontiers in Immunology. 12, 662944 (2021).
- Chávez, A. S. O., O’Neal, A. J., Santambrogio, L., Kotsyfakis, M., Pedra, J. H. F. Message in a vesicle-trans-kingdom intercommunication at the vector-host interface. Journal of Cell Science. 132 (6), 224212 (2019).
- Janas, T., Janas, M. M., Sapoń, K., Janas, T. Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS Letters. 589 (13), 1391-1398 (2015).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
- Pegtel, D. M., et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (14), 6328-6333 (2010).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Ambros, V. MicroRNAs and developmental timing. Current Opinion in Genetics and Development. 21 (4), 511-517 (2011).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Hackenberg, M., Langenberger, D., Schwarz, A., Erhart, J., Kotsyfakis, M. In silico target network analysis of de novo-discovered, tick saliva-specific microRNAs reveals important combinatorial effects in their interference with vertebrate host physiology. RNA. 23 (8), 1259-1269 (2017).
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 promotes the development of and prolongs engorgement time in Hyalomma anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) ticks. Biorxiv. , (2020).
- Zhou, J., Zhou, Y., Cao, J., Zhang, H., Yu, Y. Distinctive microRNA profiles in the salivary glands of Haemaphysalis longicornis related to tick blood-feeding. Experimental and Applied Acarology. 59 (3), 339-349 (2013).
- Hermance, M. E., Widen, S. G., Wood, T. G., Thangamani, S. Ixodes scapularis salivary gland microRNAs are differentially expressed during Powassan virus transmission. Scientific Reports. 9 (1), 1-17 (2019).
- Barrero, R. A., et al. Evolutionary conserved microRNAs are ubiquitously expressed compared to tick-specific miRNAs in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics. 12 (1), 1-17 (2011).
- Colombo, M., et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. Journal of Cell Science. 126 (24), 5553-5565 (2013).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. . Proteomic Profiling. , 179-209 (2015).
- Koga, K., et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Research. 25, 3703-3707 (2005).
- Wright, K., de Silva, K., Purdie, A. C., Plain, K. M. Comparison of methods for miRNA isolation and quantification from ovine plasma. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
- Mráz, M., Malinova, K., Mayer, J., Pospisilova, S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (1), 1-4 (2009).
- Nawaz, M., et al. miRNA profile of extracellular vesicles isolated from saliva of Haemaphysalis longicornis tick. Acta Tropica. 212, 105718 (2020).
- Ribeiro, J. M. C., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva. Medical and Veterinary Entomology. 18 (1), 20-24 (2004).
- Almazán, C., et al. A versatile model of hard tick infestation on laboratory rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Masotti, A., Preckel, T. Analysis of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer. Nature Methods. 3 (8), 658 (2006).
- Benesova, S., Kubista, M., Valihrach, L. Small RNA-sequencing: approaches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics. 11 (6), 964 (2021).
- Mackowiak, S. D. Identification of novel and known miRNAs in deep-sequencing data with miRDeep2. Current Protocols in Bioinformatics. 36 (1), 12 (2011).
- Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research. 40 (1), 37-52 (2012).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA registry. Nucleic Acids Research. 32, 109-111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, 140-144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2007).
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47, 155-162 (2019).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, 152-157 (2011).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
- Wu, F., et al. MicroRNA let-7 regulates the expression of ecdysteroid receptor (ECR) in Hyalomma asiaticum (Acari: Ixodidae) ticks. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-13 (2019).
- Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science. 2, 34 (2011).
- Merchant, N., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for enabling data to discovery for the life sciences. PLoS Biology. 14 (1), 1002342 (2016).
- Kumar, D., et al. An exploratory study on the microbiome of northern and southern populations of Ixodes scapularis ticks predicts changes and unique bacterial interactions. Pathogens. 11 (2), 130 (2022).
- Zhang, Y., et al. Exosome: a review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917 (2020).
- Di Leva, G., Croce, C. M. miRNA profiling of cancer. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (1), 3-11 (2013).
- Ganju, A., et al. miRNA nanotherapeutics for cancer. Drug Discovery Today. 22 (2), 424-432 (2017).
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 Expression and Function in Hyalomma Anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) Ticks. Frontiers in Physiology. 12, 596289 (2021).
