Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von microRNAs aus Zeckenspeicheldrüsen und gereinigten extrazellulären Vesikeln. Dies ist ein universelles Verfahren, das häufig verwendete Reagenzien und Verbrauchsmaterialien kombiniert. Die Methode ermöglicht auch die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zecken, was zu hochwertigen microRNAs führt, die leicht sequenziert werden können.
Abstract
Zecken sind wichtige Ektoparasiten, die mehrere Krankheitserreger übertragen können. Die Speicheldrüsen von Zecken sind für die Fütterung unerlässlich, da ihr Speichel viele Effektoren mit pharmazeutischen Eigenschaften enthält, die die Immunantwort des Wirts verringern und die Übertragung von Krankheitserregern verbessern können. Eine Gruppe solcher Effektoren sind microRNAs (miRNAs). miRNAs sind kurze nicht-kodierende Sequenzen, die die Expression von Wirtsgenen an der Zecken-Wirt-Grenzfläche und in den Organen der Zecke regulieren. Diese kleinen RNAs werden im Zeckenspeichel über extrazelluläre Vesikel (EVs) transportiert, die der inter- und intrazellulären Kommunikation dienen. Vesikel, die miRNAs enthalten, wurden im Speichel von Zecken identifiziert. Über die Rollen und Profile der miRNAs in Zeckenspeichelbläschen und -drüsen ist jedoch wenig bekannt. Darüber hinaus erfordert die Untersuchung von Vesikeln und miRNAs im Zeckenspeichel langwierige Verfahren, um Zeckenspeichel zu sammeln. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Isolierung von miRNAs aus gereinigten extrazellulären Vesikeln zu entwickeln und zu validieren, die von Ex-vivo-Organkulturen produziert werden. Die Materialien und die Methodik, die benötigt werden, um miRNAs aus extrazellulären Vesikeln und Zeckenspeicheldrüsen zu extrahieren, werden hierin beschrieben.
Introduction
Zecken sind Ektoparasiten, die viele Krankheitserreger auf Wildtiere, Nutztiere, Menschen und ihre Haustiere übertragen 1,2. Die Fütterung von Zecken führt zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten, indem sie die Haut schädigt, das Gewicht und die Milchproduktion aufgrund schwerer Anämie reduziert und potenziell tödliche krankheitserregende Krankheitserregerüberträgt 1,3,4,5. Die derzeitigen Kontrollpraktiken für das Management von Zeckenpopulationen konzentrieren sich auf den Einsatz von Akariziden. Dennoch haben das kontinuierliche Auftreten von Akarizidresistenzen bei Zecken, die Nutztiereparasitieren 5,6, die erhöhte Inzidenz von Zeckenstichen7 und die Übertragung von Krankheitserregern in Wohngebieten 8,9 zu einem Bedarf an einzigartigen Zeckenbekämpfungsalternativen geführt.
Die Zeckenspeicheldrüsen sind essentielle Organe, die den biologischen Erfolg einer Zecke sicherstellen. Sie werden von verschiedenen Acinus-Typen (I, II, III und IV) mit verschiedenen physiologischen Funktionen gebildet. Die Speicheldrüsen sind für die Osmoregulation, sowohl außerhalb als auch auf dem Wirt, verantwortlich, indem sie dem Wirt über Speichelfluss Wasserüberschuss und Eisengehalt zurückgeben 2,10. Typ-I-Acini sind auch an der Aufnahme von Wasser aus der Atmosphäre durch die Sekretion von hygroskopischem Speichelbeteiligt 10,11. Speicheleffektorproteine wie Zement und Cystatine werden in sekretorischen Zellen in Typ-II- und III-Acini10,12 produziert. Typ-I-Acini haben keinen Einfluss auf die Zeckenfütterung, was darauf hindeutet, dass die Blutmahlzeitenaufnahme keine morphologischen und physiologischen Veränderungen bei diesen Acini Typ13,14 auslöst. Auf der anderen Seite werden Acini Typ II und III während der Fütterung aktiviert und zeigen sehr wenig Aktivität vor der Befestigung. Daher ist die Fütterung notwendig, um die Vergrößerung der sekretorischen Zellen innerhalb von Typ-II-Acini und die Produktion bioaktiver Verbindungen auszulösen. Typ-III-Acini werden während der Fütterung aufgrund der Sekretion im sekretorischen Granulat12 verkleinert.
Die Speicheldrüsen sind auch der Ort der Erregerinfektion in der Zecke und im Übertragungsweg. Während der Fütterung sezernieren Zecken mehrere Verbindungen mit pharmazeutischer Wirkung, die für einen erfolgreichen Abschluss der Blutmahlzeitbenötigt werden 10,15,16. Diese Verbindungen haben entzündungshemmende, immunsuppressive und vasodilatatorische Eigenschaften10,15,17. Neuere Studien haben gezeigt, dass extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus Zeckenspeicheldrüsen gewonnen werden, mehrere dieser Verbindungen beherbergen und entzündungshemmende und immunmodulatorische Wirkungen induzieren18,19,20. “Extrazelluläre Vesikel” ist ein Überbegriff, der verwendet wird, um Vesikel zu beschreiben, die aufgrund ihrer Größe und Biogenese als Exosomen und Mikrovesikel klassifiziert werden. Insgesamt sind EVs Lipidblebs mit zweischichtigen Membranen, die ~ 40 nm-1 μm in Größe21 sind; Im Allgemeinen werden Exosomen als 40-150 nm groß beschrieben, während Mikrovesikel zwischen 150 nm-1 μm in der Größe21,22,23 liegen. Die Größe ist jedoch kein Hinweis auf den Biogeneseweg der EVs22.
Die Biogenese von Exosomen beginnt mit der sequentiellen Invagination der Plasmamembran. Diese Invagination führt zur Bildung von multivesikulären Körpern und führt schließlich zur Verformung der vesikulären Membran durch die Wirkung von ESCRT-Komplexen oder Sphingomyelinasen (sMases)24,25. Die Exosomen können entweder innerhalb der Lysosomen lysiert werden, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten, oder durch vesikuläre Fusion in die Plasmamembran austreten, um zelluläre Bestandteile an die Empfängerzellen zu liefern21,24. Auf der anderen Seite werden Mikrovesikel durch die Wirkung von Flopassen und Flipassen gebildet, wodurch die Konformation von Lipiden in der Plasmamembran26 verändert wird. EVs sind essentiell für die Zell-zu-Zell-Kommunikation und dienen als Transportsystem für intrazelluläre Fracht wie Lipide, Proteine, Nukleinsäuren und microRNAs (miRNAs)21,27,28. Nach dem Transport geben diese Vesikel ihre Fracht in das Zytoplasma der Empfängerzellen ab und erzeugen phänotypische Veränderungen in der aufnehmenden Zelle22,29. Aufgrund der Bedeutung extrazellulärer Vesikel bei der Zeckenfütterung und der Manipulation der Immun- und Wundheilungsreaktionen des Wirts18,20 bietet die Ladung in extrazellulären Vesikeln potenzielle Ziele für die Entwicklung von Anti-Zecken-Therapeutika und einen einzigartigen Mechanismus zur Störung der Zeckenfütterung. Dazu gehören miRNAs in Zeckenspeicheldrüsen und aus Speicheldrüsen gewonnene extrazelluläre Vesikel.
miRNAs sind kurze, nicht-kodierende Sequenzen, ~ 18-22 Nukleotid (nt) lang, die mRNA-Sequenzen30,31 posttranskriptionell regulieren, abbauen oder zum Schweigen bringen können. Während der Transkription werden die pri-miRNAs von Dicer (RNA-Polymerase III) gespalten, um eine unverwechselbare Haarnadel-ähnliche Struktur zu bilden, die zu einer Pre-miRNA wird. Die Pre-miRNA wird erneut durch Drosha (RNA-Polymerase III) geschnitten, um einen reifen miRNA-Duplex zu bilden. Die ausgereifte Sequenz wird komplementär zur mRNA-Sequenz in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) integriert, was zu einer Translationsrepression oder einem mRNA-Abbauführt 28,30,32. Während der Wirtsfütterung können miRNAs im Zeckenspeichel die Expression des Wirtsgens modulieren, um Immunantworten zu unterdrücken und die Erregerübertragungzu verbessern 33,34,35,36,37. Obwohl umfangreiche Studien zu EVs und miRNAs existieren, sind ihre Rollen während der Fütterung an der Zecken-Wirt-Schnittstelle noch wenig verstanden. Die Optimierung von Protokollen, die leicht zur Isolierung und Aufreinigung hochwertiger miRNAs führen können, ist entscheidend für die Weiterentwicklung unseres Wissens zu diesen Themen.
Zur Isolierung von Elektrofahrzeugen können mehrere Optionen verwendet werden, z. B. Ultrazentrifugation, Exosomenfällung, Polymerausfällung, Immunaffinitätschromatographie und größenbasierte Ausschlusstechniken38. Diese Techniken können jedoch nicht zwischen Exosomen oder Mikrovesikeln unterscheiden. Wie bereits erwähnt, wird EV als Oberbegriff verwendet, wenn Elektrofahrzeuge von verschiedenen Proben isoliert werden. Die in den hierin beschriebenen Experimenten isolierten Vesikel stellen eine Mischung von Vesikeln dar, die aus verschiedenen Biogenesewegen stammen. Eine weitere Aufreinigung einer spezifischen Population extrazellulärer Vesikel kann durch Immunpräzipitation unter Verwendung von Kügelchen erreicht werden, die mit Antikörpern gegen Marker (d.h. exosomale Marker, Tumormarker) beschichtet sind, die für die für die interessierende Vesikelpopulationeinzigartig sind 39,40. miRNAs können auch über verschiedene kommerziell erhältliche Isolationskits 7,41,42 extrahiert werden.
Ziel dieses Projekts war es, ein Protokoll zu entwickeln, das häufig angewandte Methoden zur Isolierung von EVs und zur Extraktion von miRNA sowohl aus EVs als auch aus Speicheldrüsen kombiniert. Da die Sekretion bioaktiver Verbindungen durch Fütterungvon 12 aktiviert wird, sollten Zecken gefüttert werden dürfen, um miRNAs zu identifizieren, die für die Manipulation der Immun- und Wundheilungsreaktionen des Wirts wichtig sein können. Das vorliegende Protokoll erfordert eine kleine Anzahl von Zecken (20 Zecken), um EVs und ihre jeweiligen miRNAs zu isolieren, verglichen mit anderen zuvor beschriebenen Studien, die 2000 Zecken43 erforderten. Darüber hinaus vermeidet es die Kontamination von Speichelsekreten mit Pilocarpin44, was Experimente beeinflussen könnte, die die Wirkung von EVs und ihren miRNAs auf Wirtszellen untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das aktuelle Protokoll bietet eine detaillierte Methodik zur Extraktion von miRNA aus Speicheldrüsen und EVs. Es gibt jedoch wichtige Überlegungen, die alle in den Anmerkungen zu jedem Abschnitt dieses Protokolls ausführlich beschrieben werden. Die Kapsel und das Netz müssen während der Zeckenfütterung gesichert werden, um zu verhindern, dass Zecken entweichen. Die Kapselvorbereitung und -platzierung sind in Koga et al.40 beschrieben. Mehrere Wiederholungen der Zeckendissektionen müssen dur…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind sehr dankbar für die Unterstützung durch das Cattle Fever Tick Laboratory in Edinburg, Texas. Wir danken Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado und Homer Vasquez. Wir möchten auch die Unterstützung von Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario und Stephanie Guzman Valencia während des gesamten Projekts danken. Wir möchten der Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group für ihre Hilfe und ihren Rat während des Schreibens dieses Manuskripts danken. Die folgenden Reagenzien wurden von den Centers for Disease Control and Prevention zur Verteilung durch BEI Resources, NIAID, NIH, zur Verfügung gestellt: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Weibliche I. scapularis-Zecken wurden auch von der Tick Rearing Facility an der Oklahoma State University erhalten. Dieses Projekt wurde von der Texas A&M University T3: triads for transformation grant und der Kooperationsvereinbarung #58-3094-1-003 des USDA-ARS an AOC finanziert.
Materials
| 0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
| 1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
| 1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
| 10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
| 3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| 4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
| 70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
| Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
| Chloroform | Macron | UN1888 | |
| Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
| Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
| fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
| Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
| Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
| L15C300 medium | In-lab | ||
| lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
| Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
| miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
| M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
| multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
| Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
| Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
| NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
| Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
| Pippettes | Ependorff | ||
| polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
| Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
| QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
| Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
| Rabbits | Charles River | ||
| Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
| Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
| RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
| RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
| RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
| RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
| Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
| Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
| streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
| TapeStation | Aligent | G2991BA | |
| Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
| Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
| Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
| Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |
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