ヒト歯からオルガノイドを機構研究・再生医療への強力なツールとして確立
Summary
我々は、ヒトの歯から出発して上皮オルガノイド培養を開発するためのプロトコルを提示する。オルガノイドは堅牢に拡張可能であり、アメロブラスト分化能を含む歯の上皮幹細胞を再現する。このユニークなオルガノイドモデルは、歯の再生アプローチの視点を持つヒト歯科(幹細胞)生物学を研究するための有望なツールを提供します。
Abstract
歯は、食物の咀嚼やスピーチだけでなく、心理的幸福のためにも人生において非常に重要です。人間の歯の発達と生物学に関する知識は乏しい。特に、歯の上皮幹細胞とその機能についてはあまり知られていません。ヒトの歯組織(抜いた親知らずから単離された歯包)を起点とした新規オルガノイドモデルの開発に成功しました。オルガノイドは堅牢かつ長期的に拡張可能であり、マーカー発現および機能活性の点で提案されたヒト歯上皮幹細胞区画を再現する。特に、オルガノイドは、アメロジェネシス中に インビボで 起こるようなアメロブラスト分化過程を展開させることができる。このユニークなオルガノイドモデルは、ヒトの歯の発達だけでなく、歯の病態を研究するための強力なツールを提供し、歯の再生治療への道を開く可能性があります。この新しいオルガノイドモデルに基づいて失われた歯を生物学的歯に置き換えることは、合成材料の現在の標準的な移植に代わる魅力的な代替手段となる可能性があります。
Introduction
歯は、食物咀嚼、スピーチ、心理的幸福(自己イメージ)に不可欠な役割を担っています。人間の歯は、さまざまな密度と硬度1の高度に石灰化された組織で構成されています。歯冠の主成分である歯科用エナメル質は、人体で最も高い石灰化組織です。エナメル質形成(アメロジェネシス)の間、歯が発達すると、歯科上皮幹細胞(DESC)はエナメル質形成細胞(アメロブラスト)に分化する。一度形成されると、エナメル質は、歯の噴火の開始時にアメロブラストのアポトーシス損失のためにめったに修復または更新されない1。損傷したエナメル質組織の修復は、外傷または細菌性疾患によって引き起こされるように、現在、合成材料を使用して達成されている。しかし、これらは、マイクロリーク、劣悪なオッセオインテグレーションとアンカー、有限寿命、および完全に機能する修復の欠如などの重要な欠点に悩まされています2。したがって、アメロブラストを生成する能力と石灰化組織を生成する可能性を備えたヒトDESCの堅牢で信頼性の高い培養は、歯科再生分野における大きな前進となるでしょう。
ヒトDESC表現型および生物学的機能に関する知識は乏しい3,4,5。興味深いことに、ヒト歯のDESCは、マラセスの上皮細胞レスト(ERM)に存在することが提案されているが、これは未発火の歯を囲む歯包(DF)内に存在し、歯が噴出すると歯根の周りの歯周靭帯に存在する1。歯髄と共培養したERM細胞は、アメロブラスト様細胞に分化し、エナメル質様組織を生成することが分かっている6。しかしながら、エナメル質(再)生成におけるERM細胞の特定の役割に関する深遠な研究は、信頼できる研究モデルの欠如のために制限されている7。現在のERMインビトロ培養システムは、8、9、10、11、12に標準的に使用されている2D条件における限られた寿命および表現型の迅速な喪失によって妨げられている。したがって、ヒトDESCを忠実に拡張、研究、および区別するための扱いやすいin vitroシステムが強く必要とされている。
過去10年間、上皮幹細胞をインビトロで増殖させる強力な技術は、いくつかのタイプの(ヒト)上皮組織に適用され、その生物学および疾患を研究することに成功している13、14、15、16。この技術により、組織上皮幹細胞は、細胞外マトリックス(ECM)を模倣した足場(典型的にはマトリゲル)に播種され、組織の幹細胞ニッチシグナル伝達および/または胚発生を複製する定義された培地で培養されると、3D細胞構造(すなわち、オルガノイド)に自己発達する。オルガノイド発生に必要な典型的な成長因子には、上皮成長因子(EGF)および翼なし型MMTV集積部位(WNT)活性化剤14、15、16が含まれる。得られたオルガノイドは、組織の元の上皮幹細胞を模倣する際の持続的な忠実度、ならびにそれらの表現型および機能的特性を保持しながら高い拡張性によって特徴付けられ、それによって診療所から取得されたしばしば制限された原発性ヒト組織の利用可能性を克服する。オルガノイドを樹立するために、培養前の異種組織(すなわち、間葉系細胞などの他の細胞型を含む)からの上皮幹細胞の単離は、間葉系細胞がECMに付着しない、またはECMで繁栄しないように必要ではなく、最終的に純粋に上皮オルガノイド13、16、17、18、19をもたらす.この有望で汎用性の高い技術は、様々なヒト上皮組織からの多様体オルガノイドモデルの開発につながった。しかし、歯の発達、再生、および疾患の深い研究に貴重なヒト歯由来オルガノイドは、まだ確立されていませんでした20,21。我々は最近、青年期患者19から抽出した第3大臼歯(親知らず)からのDF組織を起点としたこのような新しいオルガノイドモデルの開発に成功した。
ここで、我々は、成体ヒト歯から(すなわち、第3大臼歯のDFから)上皮オルガノイド培養を開発するためのプロトコールを記載する(図1A)。得られたオルガノイドは、ERM関連ステムネスマーカーを発現しながら、長期的に拡張可能である。興味深いことに、他のほとんどのオルガノイドモデルとは対照的に、典型的に必要とされるEGFは、堅牢なオルガノイドの発生および成長のために冗長である。興味深いことに、ステムネスオルガノイドはアメロブラスト分化特性を示し、それによって インビボで起こるERM/DESCの特徴およびプロセスを模倣する。ここで説明する新しくユニークなオルガノイドモデルは、DESCの生物学、可塑性、分化能力を探求することを可能にし、歯の再生アプローチへの第一歩を踏み出すための扉を開きます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ヒトの歯から始まるオルガノイドの効率的かつ再現性のある生成を記述する。我々の知る限り、これはヒトの歯科組織から始まる現在の概念(上皮)オルガノイドを確立するための最初の方法論である。オルガノイドは長期拡張可能であり、歯の上皮ステムネス表現型を示し、DF7のERMコンパートメントで以前に報告されたDESCを複製する。さらに、オルガノ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UZ Leuvenの口腔および顎顔面外科(MKA)のすべてのスタッフと患者、新しく抽出された第3大臼歯の収集における貴重な支援に感謝しています。また、ラインヒルデ・ジェイコブス博士とエリザベス・ティスケンス博士のサンプル収集に協力してくれたことにも感謝します。この研究は、ルーヴェン大学(BOF)とFWO-フランダース(G061819N)からの助成金によって支援されました。L.H.はFWO博士研究員(1S84718N)です。
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
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