İnsan Dişinden Organoidlerin Mekanik Araştırma ve Rejeneratif Terapiye Doğru Güçlü Bir Araç Olarak Kurulması
Summary
İnsan dişinden başlayarak epitelyal organoid kültürlerin geliştirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Organoidler sağlam bir şekilde genişletilebilir ve ameloblast farklılaşma kapasiteleri de dahil olmak üzere dişin epitel kök hücrelerini özetler. Eşsiz organoid model, insan diş (kök hücre) biyolojisini diş rejeneratif yaklaşımlar için perspektiflerle incelemek için umut verici bir araç sağlar.
Abstract
Dişler hayatta sadece gıda çiğnemesi ve konuşma için değil, aynı zamanda psikolojik iyi oluş için de kilit öneme sahiptir. İnsan diş gelişimi ve biyolojisi hakkında bilgi azdır. Özellikle, dişin epitel kök hücreleri ve işlevleri hakkında fazla bir şey bilinmemektedir. İnsan diş dokusundan (yani, çıkarılan bilgelik dişlerinden izole edilmiş diş folikülü) başlayan yeni bir organoid model geliştirmeyi başardık. Organoidler sağlam ve uzun süreli genişletilebilir olup, önerilen insan dişi epitel kök hücre bölmesini belirteç ekspresyonu ve fonksiyonel aktivite açısından özetler. Özellikle, organoidler, amelogenez sırasında in vivo olarak meydana gelen bir ameloblast farklılaşma sürecini ortaya çıkarabilir. Bu eşsiz organoid model, sadece insan diş gelişimini değil, aynı zamanda diş patolojisini de incelemek için güçlü bir araç sağlayacak ve diş rejeneratif tedavisine giden yolu açabilir. Kayıp dişlerin bu yeni organoid modele dayanan biyolojik bir dişle değiştirilmesi, sentetik malzemelerin mevcut standart implantasyonuna çekici bir alternatif olabilir.
Introduction
Dişlerin gıda çiğneme, konuşma ve psikolojik iyi oluşta (benlik imajı) önemli rolleri vardır. İnsan dişi, değişen yoğunluk ve sertlikte yüksek mineralize dokulardan oluşur1. Diş kronunun ana bileşeni olan diş minesi, insan vücudundaki en yüksek mineralize dokudur. Emaye oluşumu sırasında (amelogenez), dişler geliştiğinde, diş epitel kök hücreleri (DESC’ler) emaye oluşturan hücrelere (ameloblastlar) farklılaşır. Bir kez oluştuktan sonra, diş erüpsiyonunun başlangıcında ameloblastların apoptotik kaybı nedeniyle emaye nadiren onarılır veya yenilenir1. Travma veya bakteriyel hastalığın neden olduğu hasarlı emaye dokusunun restorasyonu şu anda sentetik malzemeler kullanılarak gerçekleştirilmektedir; ancak bunlar mikrokaçak, inferior osseointegrasyon ve ankraj, sonlu ömür ve tam fonksiyonel onarım eksikliği gibi önemli eksikliklerle uğraşmaktadır2. Bu nedenle, ameloblast üretme kapasitesine ve mineralize doku üretme potansiyeline sahip sağlam ve güvenilir bir insan DESC kültürü, dental rejeneratif alanda ileriye doğru atılmış önemli bir adım olacaktır.
İnsan DESC fenotipi ve biyolojik fonksiyonu hakkında bilgi azdır 3,4,5. İlginçtir ki, insan dişlerinin DESC’lerinin, Malassez’in Epitel Hücre Dayanaklarında (ERM), diş folikülünde (DF) bulunan ve diş patladığında kök çevresindeki periodontal ligamentte mevcut olan hücre kümelerinde var olduğu öne sürülmüştür1. Diş pulpası ile birlikte kültürlenmiş ERM hücrelerinin ameloblast benzeri hücrelere farklılaştığı ve mine benzeri doku ürettiği bulunmuştur6. Bununla birlikte, ERM hücrelerinin emaye (yeniden) üretimindeki spesifik rolüne ilişkin derin çalışmalar, güvenilir çalışma modellerinin eksikliği nedeniyle sınırlandırılmıştır7. Mevcut ERM in vitro kültür sistemleri, standart olarak kullanılan 8,9,10,11,12 2D koşullarında sınırlı kullanım ömrü ve hızlı fenotip kaybı nedeniyle engellenmektedir. Bu nedenle, insan DESC’lerini sadık bir şekilde genişletmek, incelemek ve ayırt etmek için izlenebilir bir in vitro sisteme şiddetle ihtiyaç vardır.
Son on yılda, in vitro epitel kök hücrelerini büyütmek için güçlü bir teknik, biyolojilerini ve hastalık13,14,15,16’yı incelemek için çeşitli (insan) epitel dokularına başarıyla uygulanmıştır. Bu teknoloji, doku epitel kök hücrelerinin, hücre dışı bir matrise (ECM) tohumlandığında, hücre dışı bir matrise (ECM) tohumlandığında (tipik olarak, Matrigel) ve dokunun kök hücre niş sinyalini ve / veya embriyogenezini kopyalayan tanımlanmış bir ortamda kültürlendiğinde 3D hücre yapılarına (yani organoidlere) kendi kendine gelişmesini sağlar. Organoid gelişim için gerekli tipik büyüme faktörleri epidermal büyüme faktörü (EGF) ve kanatsız tip MMTV entegrasyon bölgesi (WNT) aktivatörleri 14,15,16’dır. Ortaya çıkan organoidler, dokunun orijinal epitel kök hücrelerini taklit etmede kalıcı sadakatin yanı sıra, fenotip ve fonksiyonel özelliklerini korurken yüksek genişletilebilirlik ile karakterize edilir, böylece klinikten elde edilen sıklıkla sınırlı birincil insan dokusu mevcudiyetinin üstesinden gelir. Organoidleri oluşturmak için, epitel kök hücrelerinin kültürlemeden önce heterojen dokudan (yani, mezenkimal hücreler gibi diğer hücre tiplerini içeren) izolasyonu gerekli değildir, çünkü mezenkimal hücreler ECM’ye bağlanmaz veya gelişmez, sonuçta tamamen epitel organoidleriile sonuçlanır 13,16,17,18,19 . Bu umut verici ve çok yönlü teknoloji, çeşitli insan epitel dokularından manifold organoid modellerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, diş gelişimi, rejenerasyonu ve hastalığının derinlemesine incelenmesi için değerli olan insan dişi kaynaklı organoidler henüz kurulmamıştır20,21. Son zamanlarda, ergen hastalardan çıkarılan üçüncü azı dişlerinden (bilgelik dişleri) DF dokusundan başlayarak böyle yeni bir organoid model geliştirmeyi başardık19.
Burada, yetişkin insan dişinden (yani, üçüncü azı dişlerinin DF’sinden) epitel organoid kültürleri geliştirme protokolünü açıklıyoruz (Şekil 1A). Ortaya çıkan organoidler, ERM ile ilişkili sap belirteçlerini eksprese ederken, uzun süreli genişletilebilir. İlginçtir ki, diğer organoid modellerin çoğunun aksine, tipik olarak ihtiyaç duyulan EGF, sağlam organoid gelişimi ve büyümesi için gereksizdir. İlginç bir şekilde, saplılık organoidleri ameloblast farklılaşma özellikleri gösterir, böylece ERM / DESC özelliklerini ve in vivo olarak meydana gelen süreçleri taklit eder. Burada açıklanan yeni ve benzersiz organoid model, DESC biyolojisini, plastisitesini ve farklılaşma kapasitesini keşfetmeye izin verir ve diş rejeneratif yaklaşımlara doğru ilk adımları atmak için kapıyı açar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, insan dişinden başlayarak organoidlerin verimli ve tekrarlanabilir oluşumunu tanımlar. Bildiğimiz kadarıyla bu, insan diş dokusundan başlayarak akım kavramı (epitelyal) organoidlerin kurulması için ilk metodolojidir. Organoidler uzun süreli genişletilebilir ve daha önce DF7’nin ERM bölmesinde bildirilen DESC’leri çoğaltan bir diş epitelyal sap fenotipi gösterir. Ayrıca, organoidler, bir ameloblast farklılaşma sürecinin ortaya çıkması da dahil olmak üzere fo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UZ Leuven’in Ağız Diş ve Çene Cerrahisi (MKA) personeline ve hastalara, taze çıkarılmış üçüncü azı dişlerinin toplanmasındaki paha biçilmez yardımları için minnettarız. Ayrıca örnek toplama konusundaki yardımları için Dr. Reinhilde Jacobs ve Dr. Elisabeth Tijskens’e teşekkür ederiz. Bu çalışma KU Leuven (BOF) ve FWO-Flanders (G061819N) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir. L.H. FWO Ph.D. Fellow’dur (1S84718N).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
Riferimenti
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).
