Etablera organoider från mänsklig tand som ett kraftfullt verktyg mot mekanistisk forskning och regenerativ terapi
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att utveckla epitelorganoidkulturer med utgångspunkt från mänsklig tand. Organoiderna är robust expanderbara och rekapitulerar tandens epitelstamceller, inklusive deras ameloblastdifferentieringskapacitet. Den unika organoidmodellen ger ett lovande verktyg för att studera människans tandbiologi med perspektiv för tandregenerativa metoder.
Abstract
Tänder är av avgörande betydelse i livet, inte bara för matmastik och tal utan också för psykologiskt välbefinnande. Kunskap om mänsklig tandutveckling och biologi är knapp. I synnerhet är inte mycket känt om tandens epitelstamceller och deras funktion. Vi lyckades utveckla en ny organoidmodell med utgångspunkt från mänsklig tandvävnad (dvs. tandfollikel, isolerad från extraherade visdomständer). Organoiderna är robust och långsiktigt expanderbara och rekapitulerar det föreslagna humana tandepiteliala stamcellsfacket när det gäller marköruttryck såväl som funktionell aktivitet. I synnerhet kan organoiderna utveckla en ameloblastdifferentieringsprocess som förekommer in vivo under amelogenes. Denna unika organoidmodell kommer att ge ett kraftfullt verktyg för att studera inte bara mänsklig tandutveckling utan också tandpatologi och kan bana väg för tandregenerativ terapi. Att ersätta förlorade tänder med en biologisk tand baserad på denna nya organoidmodell kan vara ett tilltalande alternativ till den nuvarande standardimplantationen av syntetiska material.
Introduction
Tänder har viktiga roller i matmasticering, tal och psykologiskt välbefinnande (självbild). Den mänskliga tanden består av mycket mineraliserade vävnader med varierande densitet och hårdhet1. Tandemaljen, huvudkomponenten i tandkronan, är den högsta mineraliserade vävnaden i människokroppen. Under emaljbildning (amelogenes), när tänderna utvecklas, differentieras tandepitelstamceller (DESC) till emaljbildande celler (ameloblaster). När den väl har bildats repareras eller förnyas emaljen sällan på grund av den apoptotiska förlusten av ameloblasterna vid början av tandutbrott1. Restaurering av skadad emaljvävnad, orsakad av trauma eller bakteriell sjukdom, utförs för närvarande med hjälp av syntetiska material; dessa är dock oroliga med viktiga brister som mikroleakage, sämre osseointegration och förankring, ändlig livslängd och brist på fullt fungerande reparation2. Därför skulle en robust och pålitlig odling av humana DESC med kapacitet att generera ameloblaster och potential att producera mineraliserad vävnad vara ett stort steg framåt inom det dentala regenerativa området.
Kunskap om human DESC fenotyp och biologisk funktion är knapp 3,4,5. Intressant nog har DESC av mänskliga tänder föreslagits att existera i Epitelcellsvila i Malassez (ERM), cellkluster som finns i tandfollikeln (DF), som omger oeruperade tänder och förblir närvarande i det parodontala ligamentet runt roten när tanden bryter ut1. ERM-celler samodlade med tandmassa har visat sig differentieras till ameloblastliknande celler och generera emaljliknande vävnad6. Djupgående studier av ERM-cellernas specifika roll i emaljgenerering (åter) har dock begränsats på grund av bristen på tillförlitliga studiemodeller7. Nuvarande ERM-in vitro-odlingssystem hämmas av begränsad livslängd och snabb förlust av fenotyp under de 2D-förhållanden som vanligtvis används 8,9,10,11,12. Därför behövs ett lätthanterligt in vitro-system för att troget expandera, studera och differentiera humana DESC.
Under det senaste decenniet har en kraftfull teknik för att odla epitelstamceller in vitro framgångsrikt tillämpats på flera typer av (mänskliga) epitelvävnader för att studera deras biologi såväl som sjukdom 13,14,15,16. Denna teknik gör det möjligt för vävnadsepitelstamcellerna att självutvecklas till 3D-cellkonstruktioner (dvs. organoider) när de sås in i en extracellulär matris (ECM) -härmande ställning (vanligtvis Matrigel) och odlas i ett definierat medium som replikerar vävnadens stamcellsnischsignalering och / eller embryogenes. Typiska tillväxtfaktorer som behövs för organoidutveckling inkluderar epidermal tillväxtfaktor (EGF) och mmtv-integrationsställen (WNT) av vinglös typ 14,15,16. De resulterande organoiderna kännetecknas av varaktig trohet när det gäller att efterlikna vävnadens ursprungliga epitelstamceller, liksom hög expanderbarhet samtidigt som de behåller sin fenotyp och funktionella egenskaper och därigenom övervinner den ofta begränsade primära mänskliga vävnadstillgängligheten som förvärvats från kliniken. För att etablera organoider krävs inte isolering av epitelstamcellerna från den heterogena vävnaden (dvs. innefattande andra celltyper såsom mesenkymala celler) före odling eftersom mesenkymala celler inte fäster vid eller trivs i ECM, vilket så småningom resulterar i rent epitelorganoider 13,16,17,18,19 . Denna lovande och mångsidiga teknik har lett till utvecklingen av mångfaldiga organoidmodeller från olika mänskliga epitelvävnader. Emellertid var mänskliga tand-härledda organoider, värdefulla för djup studie av tandutveckling, regenerering och sjukdom, inte etablerade ännu20,21. Vi lyckades nyligen utveckla en sådan ny organoidmodell med utgångspunkt från DF-vävnad från tredje molar (visdomständer) extraherade från ungdomar19.
Här beskriver vi protokollet för att utveckla epitelorganoidkulturer från den vuxna mänskliga tanden (dvs från DF för tredje molar) (Figur 1A). De resulterande organoiderna uttrycker ERM-associerade stamhetsmarkörer samtidigt som de är långsiktigt expanderbara. Intressant nog, i motsats till de flesta andra organoidmodeller, är den vanligtvis nödvändiga EGF överflödig för robust organoidutveckling och tillväxt. Intressant nog visar stamorganoiderna ameloblastdifferentieringsegenskaper och efterliknar därmed ERM / DESC-egenskaper och processer som förekommer in vivo. Den nya och unika organoidmodellen som beskrivs här gör det möjligt att utforska DESC-biologi, plasticitet och differentieringskapacitet och öppnar dörren för att ta de första stegen mot tandregenerativa tillvägagångssätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver den effektiva och reproducerbara genereringen av organoider med utgångspunkt från den mänskliga tanden. Såvitt vi vet är detta den första metoden för att etablera nuvarande koncept (epiteliala) organoider med utgångspunkt från mänsklig tandvävnad. Organoiderna är långsiktigt expanderbara och uppvisar en tandepitelstamhetsfenotyp, som duplicerar DESC som tidigare rapporterats i ERM-facket i DF7. Dessutom replikerar organoiderna funktionella DESC / ERM-egenskap…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för alla anställda vid oral och maxillofacial kirurgi (MKA) av UZ Leuven, liksom patienterna, för deras ovärderliga hjälp med att samla in nyligen extraherade tredje molarer. Vi vill också tacka Dr. Reinhilde Jacobs och Dr. Elisabeth Tijskens för deras hjälp med provinsamlingen. Detta arbete stöddes av bidrag från KU Leuven (BOF) och FWO-Flandern (G061819N). L.H. är en FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
Riferimenti
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).
