인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화
Summary
우리는 인간 공학 골격근 조직과 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 신경근 접합 기능을 특성화하기 위한 재현 가능하고 자동화되고 편향되지 않은 이미징 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결성의 기능적 정량화를 허용하고 신경 독소 및 중증 근무력증 환자 혈청으로 인한 감소 된 신경 근육 기능을 감지합니다.
Abstract
중증 근무력증 (MG)과 같은 많은 신경 근육 질환은 동물과 인간 사이의 생리적 차이로 인해 동물 모델에서 특성화하기가 어려운 신경 근육 접합부 (NMJ)의 기능 장애와 관련이 있습니다. 조직 공학은 NMJ 병리를 진단 및 조사하고 잠재적 치료제를 테스트하는 데 사용할 수있는 기능적 인간 NMJ의 시험관 내 모델을 제공 할 수있는 기회를 제공합니다. 광유전학 단백질을 유도만능줄기세포(iPSCs)에 통합함으로써, 우리는 특정 파장의 빛으로 자극될 수 있는 뉴런을 생성했다. NMJ가 건강하고 기능적이라면, 모토뉴론으로부터의 신경화학적 신호는 근육 수축을 초래한다. 광유전학과 미세 제작을 조직 공학과 통합함으로써 우리는 비디오 분석을 사용하여 NMJ 기능을 특성화하기위한 편견없는 자동화 된 방법론을 수립했습니다. NMJ 형성, 동시 비디오 녹화를 통한 광학 자극 및 조직 수축성의 비디오 분석을 위해 표준화 된 프로토콜이 개발되었습니다. 골격근 수축을 유도하기 위해 빛에 의한 광유전학적 모토뉴런의 자극은 인간 NMJ 생리학을 되풀이하고 시간에 따라 그리고 다양한 입력에 반응하여 NMJ의 반복적인 기능적 측정을 허용한다. 우리는 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결의 기능적 개선을 보여주고 NMJ 기능에 대한 환자 MG 항체 또는 신경 독소의 손상 효과를 특성화하는 이 플랫폼의 능력을 입증합니다.
Introduction
신경 근육 접합부 (NMJ)는 근육 수축을 허용하는 모토 뉴런 (MN)과 골격근 세포 (SkM) 사이의 화학적 시냅스입니다. 독소, 예컨대 신경독소 α-분가로톡신 (BTX), 또는 중증 근무력증 (MG)과 같은 신경근 질환 (NMD)은 NMJ의 변성 및 근육 조절의 감소를 야기할 수 있다1. 생체 공학 인간 조직 모델은 인간 NMJ의 기능적 및 생리적 메커니즘을 더 잘 재구성하고 동물 모델보다 더 큰 번역 잠재력을 제공합니다.
동물 모델이 NMJ의 형성과 기능에 대한 이해를 향상 시켰지만, 인간과 동물의 시냅스 사이에는 결과의 번역을 제한하고 NMJ의 생체 내 특성화를 도전하는 2,3,4에 도전하는 상당한 차이가 있습니다. 연구에 따르면 마우스와 인간 NMJ 사이에 뚜렷한 생리적 차이가 나타났습니다. 마우스는 인간 NMJs4와 비교할 때 더 큰 NMJ와 더 작은 활성 영역밀도를 가지고 있습니다. 또한 동물 모델에서 수행 된 약물 연구가 인간 임상 시험에서 발견 된 효과를 항상 반영하는 것은 아닙니다. 조작 된 인간 조직 모델은 NMJ의 건강한 발달과 신경 근육 질환의 병리학을 연구하고 약물 검사를 허용 할 수있는 기회를 제공합니다. 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs)5는 골격근세포(6,7) 및 모토뉴런(8,9)을 포함하는 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있다. hiPSC는 환자 세포로부터 쉽게 생성될 수 있어, 환자 특이적 조직 모델을 통해 더 나은 질병 모델링(10) 및 약물 스크리닝(11,12)을 가능하게 한다.
SkMs와 MN의 2차원(2D) 단층 공동 배양은 생리학적 NMJ의 형태, 표현형, 조직 및 기능적 거동이 부족합니다. NMJ는 분석을 위한 운동 유닛의 분리를 억제하고, 정확한 기능 측정을 제한하며, 반복적이고 체계적인 실험에 대한 사용을 방해하는 2D 배양물에서 무작위로 형성됩니다.13 . NMJs의 3차원(3D) 조직 모델은 이러한 많은 한계를 극복하여, 생리학적 NMJs 7,14,15,16,17의 형태학적 및 기능적 특성을 되풀이한다. 이 모델을 사용하여 두 가지 조직 유형을 별도로 개발 한 다음 축삭 성장을 지시하여 통합하여 2D 배양 시스템에 비해 더 체계적인 NMJ를 개발할 수 있습니다.
우리의 이전 연구는 광유전학과 조직 공학을 결합하면 NMJ 기능18,19의 정확한 비 침습적 자극 및 평가를 가능하게한다는 것을 보여주었습니다. 유전 공학을 통해 빛에 민감한 단백질은 hiPSC의 게놈에 통합 될 수 있습니다. 청색광에 반응하여 열리는 이온 채널인 채널로돕신-2(ChR2)를 뉴런과 같은 흥분성 세포의 막으로 통합하면 세포 활성화20,21,22에 대한 비접촉식 시공간 조절이 가능하다. ChR2를 운반하는 hiPSC는 청색광에 민감한 광유전학적 모토뉴런으로 분화될 수 있어, 뉴런을 자극하는 전형적인 침습성 전극의 필요성을 제거하고 전극(23)에 의한 근육 세포의 원치 않는 자극을 피한다. 이 시스템은 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 비광유전학적 골격근 세포의 수축을 자극합니다. 비디오 획득과 제어된 청색광 조명을 결합하면 NMJ 기능을 위해 공동 배양된 조직을 동시에 자극하고 기록할 수 있습니다.
MG는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (AChR)를 표적화하는 자가항체에 의해 유발되며, 이는 NMJ 기능 감소 및 근육 약화24를 초래한다. 그것은 제시된 증상, 전기 진단 및 혈청 학적 혈액 검사를 통해자가 항체의 검출을 기반으로 진단됩니다. 그러나 MG에 관여하는 모든 자가항체가 확인된 것은 아니며, 일부 혈청음성 환자는 MG로 진단되지만25,26개의 항체가 인정되지 않았다. 우리의 시스템은 MG 환자로부터의 혈청의 첨가 전후에 NMJ의 반복적 인 기능적 평가를 허용하여 MG 항체18에 의해 야기 된 기능적 및 생화학 적 변화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 우리의 프로토콜은 NMJ 병리를 진단 및 조사하고 잠재적 인 치료제를 테스트하는 데 사용할 수있는 기능적 인간 NMJ의 시험관 내 모델을 생산하는 방법을 보여줍니다. 우리는 두 개의 플랫폼, 미세 유체 장치 및 더 큰 오픈 웰 생물 반응기 플랫폼에서 시스템의 다양성을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 시스템은 광유전학과 비디오 처리를 결합하여 NMJ 기능에 대한 자동화되고 편견없는 평가를 가능하게하는 엔지니어링 된 3D 인간 조직 모델입니다. 표준화 된 프로토콜을 사용하여 우리는 생리 발달 동안 NMJ 기능의 변화를 측정하고 신경 독소 노출 및 중증 근무력증 환자 혈청과 같은 병리학의 해로운 영향을 특성화하는 능력을 입증했습니다.
이전의 연구들은 MG 환자 혈청<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 NIH [보조금 번호 EB025765 및 EB027062], DOD [수상 번호 W81XWH-18-1-0095] 및 엔지니어링을 통한 UCSF 건강 혁신 (HIVE 펠로우십)의 자금 지원을 감사하게 생각합니다. 우리는 컬럼비아 대학 줄기 세포 코어가 세포 재 프로그래밍에 대한 도움과지도에 대해 감사하게 인정합니다.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
Riferimenti
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