Мы описываем воспроизводимую, автоматизированную и непредвзятую систему визуализации для характеристики функции нервно-мышечного соединения с использованием искусственной скелетной мышечной ткани человека и оптогенетических мотонейронов. Эта система позволяет проводить функциональную количественную оценку нервно-мышечной связности с течением времени и обнаруживает снижение нервно-мышечной функции, вызванное нейротоксинами и миастенией в сыворотке крови пациента.
Многие нервно-мышечные заболевания, такие как миастения (МГ), связаны с дисфункцией нервно-мышечного соединения (NMJ), которую трудно охарактеризовать на животных моделях из-за физиологических различий между животными и людьми. Тканевая инженерия предлагает возможности для предоставления in vitro моделей функциональных NMJ человека, которые могут быть использованы для диагностики и исследования патологий NMJ и тестирования потенциальных терапевтических средств. Включив оптогенетические белки в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), мы создали нейроны, которые можно стимулировать с помощью определенных длин волн света. Если NMJ здоров и функционален, нейрохимический сигнал от мотонейрона приводит к сокращению мышц. Благодаря интеграции оптогенетики и микрофабрикации с тканевой инженерией мы создали объективную и автоматизированную методологию характеристики функции NMJ с использованием видеоанализа. Разработан стандартизированный протокол формирования NMJ, оптической стимуляции с одновременной видеозаписью и видеоанализа сократимости тканей. Стимуляция оптогенетических мотонейронов светом для индуцирования сокращений скелетных мышц повторяет физиологию NMJ человека и позволяет проводить повторные функциональные измерения NMJ с течением времени и в ответ на различные входы. Мы демонстрируем способность этой платформы демонстрировать функциональные улучшения в нервно-мышечной связности с течением времени и характеризовать повреждающее воздействие антител или нейротоксинов пациента на функцию NMJ.
Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой химический синапс между мотонейронами (MNs) и клетками скелетных мышц (SkM), который позволяет сокращать мышцы. Токсины, такие как нейротоксин α-бунгаротоксин (BTX), или нервно-мышечные заболевания (NMD), такие как миастения (MG), могут привести к дегенерации NMJ и снижению мышечного контроля1. Биоинженерные модели тканей человека лучше отражают функциональные и физиологические механизмы НМЖ человека и предлагают больший трансляционный потенциал, чем животные модели.
В то время как животные модели продвинули понимание формирования и функции NMJ, существуют значительные различия между синапсами человека и животных, которые ограничивают трансляцию результатов людям и делают характеристику NMJ in vivo сложной 2,3,4. Исследования показали отчетливые физиологические различия между NMJ мышей и людей. Мыши имеют большие NMJ и меньшую плотность активных зон по сравнению с NMJ человека4. Кроме того, исследования лекарств, проведенные на животных моделях, не всегда отражают эффекты, обнаруженные в клинических испытаниях на людях. Инженерные модели тканей человека дают возможность изучать здоровое развитие NMJ и патологию нервно-мышечных заболеваний и позволяют проводить скрининг лекарств. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs)5 могут быть дифференцированы на различные типы клеток, включая клетки скелетных мышц 6,7 и мотонейроны 8,9. hiPSCs могут быть легко получены из клеток пациента, что позволяет лучше моделировать заболевание10 и скрининг лекарств11,12 с помощью моделей тканей, специфичных для пациента.
Двумерным (2D) монослойным кокультурам SkMs и MNs не хватает морфологии, фенотипа, организации и функционального поведения физиологических NMJ. NMJ случайным образом формируются в 2D-культуре, что ингибирует выделение двигательных единиц для анализа, ограничивает точные функциональные измерения и препятствует их использованию для повторных, систематических экспериментов13 . Трехмерные (3D) тканевые модели NMJ преодолевают многие из этих ограничений, повторяя морфологические и функциональные характеристики физиологических NMJ 7,14,15,16,17. Используя эту модель, два типа тканей разрабатываются отдельно, а затем интегрируются путем направления роста аксонов, что позволяет развиваться более организованным NMJ по сравнению с системами 2D-культур.
Наше предыдущее исследование показало, что сочетание оптогенетики с тканевой инженерией может обеспечить точную неинвазивную стимуляцию и оценку функции NMJ18,19. С помощью генной инженерии светочувствительные белки могут быть интегрированы в геном hiPSCs. Интеграция канала родопсина-2 (ChR2), ионного канала, который открывается в ответ на синий свет, в мембрану возбудимых клеток, таких как нейроны, позволяет осуществлять бесконтактный пространственно-временный контроль над активацией клеток 20,21,22. hiPSCs, несущие ChR2, могут быть дифференцированы в оптогенетические мотонейроны, чувствительные к синему свету, устраняя необходимость в типичных инвазивных электродах, которые стимулируют нейроны, и избегая нежелательной стимуляции мышечных клеток электродами23. Эта система использует оптогенетические мотонейроны для стимуляции сокращений в неоптогенетических клетках скелетных мышц. Сочетание сбора видео и контролируемого освещения синим светом позволяет одновременно стимулировать и записывать совместно культивируемые ткани для функции NMJ.
MG вызывается аутоантителами, нацеленными на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (AChR), что приводит к снижению функции NMJ и мышечной слабости24. Он диагностируется на основе представленных симптомов, электродиагностики и обнаружения аутоантител с помощью серологических анализов крови. Тем не менее, не все аутоантитела, участвующие в МГ, были идентифицированы, и у некоторых серонегативных пациентов диагностируется МГ, но без признанных антител25,26. Наша система позволяет проводить повторную функциональную оценку NMJ до и после добавления сыворотки от пациентов с МГ, обеспечивая бесценную информацию о функциональных и биохимических изменениях, вызванных антителами MG18. Наш протокол иллюстрирует, как создавать 3D-модели in vitro функционального NMJ человека, которые могут быть использованы для диагностики и исследования патологий NMJ и тестирования потенциальных терапевтических средств. Мы демонстрируем универсальность системы на двух платформах: микрофлюидном устройстве и более крупной платформе биореактора с открытой скважиной.
Эта система представляет собой инженерную 3D-модель тканей человека, которая сочетает в себе оптогенетику и обработку видео, чтобы обеспечить автоматизированную и непредвзятую оценку функции NMJ. Используя стандартизированный протокол, мы продемонстрировали способность измерять изме?…
The authors have nothing to disclose.
Мы с благодарностью признаем финансовую поддержку со стороны NIH [номера грантов EB025765 и EB027062], DOD [номер награды W81XWH-18-1-0095] и UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Мы с благодарностью благодарим Columbia University Stem Cell Core за их помощь и руководство по перепрограммированию клеток.
Cells | |||
SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
Media and Supplements | |||
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
Matrigel | Corning | 354277 | |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
Plasticware | |||
30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
Optics | |||
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
Molds | |||
Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
Growth Factors | |||
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
Antibodies | |||
α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
Equipment | |||
Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
Software | |||
Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
Matlab | Matlab | R2021b | |
NIS elements | Nikon | Basic Research | |
Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |