Разработка и характеристика оптогенетической модели нервно-мышечного соединения человека
Summary
Мы описываем воспроизводимую, автоматизированную и непредвзятую систему визуализации для характеристики функции нервно-мышечного соединения с использованием искусственной скелетной мышечной ткани человека и оптогенетических мотонейронов. Эта система позволяет проводить функциональную количественную оценку нервно-мышечной связности с течением времени и обнаруживает снижение нервно-мышечной функции, вызванное нейротоксинами и миастенией в сыворотке крови пациента.
Abstract
Многие нервно-мышечные заболевания, такие как миастения (МГ), связаны с дисфункцией нервно-мышечного соединения (NMJ), которую трудно охарактеризовать на животных моделях из-за физиологических различий между животными и людьми. Тканевая инженерия предлагает возможности для предоставления in vitro моделей функциональных NMJ человека, которые могут быть использованы для диагностики и исследования патологий NMJ и тестирования потенциальных терапевтических средств. Включив оптогенетические белки в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), мы создали нейроны, которые можно стимулировать с помощью определенных длин волн света. Если NMJ здоров и функционален, нейрохимический сигнал от мотонейрона приводит к сокращению мышц. Благодаря интеграции оптогенетики и микрофабрикации с тканевой инженерией мы создали объективную и автоматизированную методологию характеристики функции NMJ с использованием видеоанализа. Разработан стандартизированный протокол формирования NMJ, оптической стимуляции с одновременной видеозаписью и видеоанализа сократимости тканей. Стимуляция оптогенетических мотонейронов светом для индуцирования сокращений скелетных мышц повторяет физиологию NMJ человека и позволяет проводить повторные функциональные измерения NMJ с течением времени и в ответ на различные входы. Мы демонстрируем способность этой платформы демонстрировать функциональные улучшения в нервно-мышечной связности с течением времени и характеризовать повреждающее воздействие антител или нейротоксинов пациента на функцию NMJ.
Introduction
Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой химический синапс между мотонейронами (MNs) и клетками скелетных мышц (SkM), который позволяет сокращать мышцы. Токсины, такие как нейротоксин α-бунгаротоксин (BTX), или нервно-мышечные заболевания (NMD), такие как миастения (MG), могут привести к дегенерации NMJ и снижению мышечного контроля1. Биоинженерные модели тканей человека лучше отражают функциональные и физиологические механизмы НМЖ человека и предлагают больший трансляционный потенциал, чем животные модели.
В то время как животные модели продвинули понимание формирования и функции NMJ, существуют значительные различия между синапсами человека и животных, которые ограничивают трансляцию результатов людям и делают характеристику NMJ in vivo сложной 2,3,4. Исследования показали отчетливые физиологические различия между NMJ мышей и людей. Мыши имеют большие NMJ и меньшую плотность активных зон по сравнению с NMJ человека4. Кроме того, исследования лекарств, проведенные на животных моделях, не всегда отражают эффекты, обнаруженные в клинических испытаниях на людях. Инженерные модели тканей человека дают возможность изучать здоровое развитие NMJ и патологию нервно-мышечных заболеваний и позволяют проводить скрининг лекарств. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs)5 могут быть дифференцированы на различные типы клеток, включая клетки скелетных мышц 6,7 и мотонейроны 8,9. hiPSCs могут быть легко получены из клеток пациента, что позволяет лучше моделировать заболевание10 и скрининг лекарств11,12 с помощью моделей тканей, специфичных для пациента.
Двумерным (2D) монослойным кокультурам SkMs и MNs не хватает морфологии, фенотипа, организации и функционального поведения физиологических NMJ. NMJ случайным образом формируются в 2D-культуре, что ингибирует выделение двигательных единиц для анализа, ограничивает точные функциональные измерения и препятствует их использованию для повторных, систематических экспериментов13 . Трехмерные (3D) тканевые модели NMJ преодолевают многие из этих ограничений, повторяя морфологические и функциональные характеристики физиологических NMJ 7,14,15,16,17. Используя эту модель, два типа тканей разрабатываются отдельно, а затем интегрируются путем направления роста аксонов, что позволяет развиваться более организованным NMJ по сравнению с системами 2D-культур.
Наше предыдущее исследование показало, что сочетание оптогенетики с тканевой инженерией может обеспечить точную неинвазивную стимуляцию и оценку функции NMJ18,19. С помощью генной инженерии светочувствительные белки могут быть интегрированы в геном hiPSCs. Интеграция канала родопсина-2 (ChR2), ионного канала, который открывается в ответ на синий свет, в мембрану возбудимых клеток, таких как нейроны, позволяет осуществлять бесконтактный пространственно-временный контроль над активацией клеток 20,21,22. hiPSCs, несущие ChR2, могут быть дифференцированы в оптогенетические мотонейроны, чувствительные к синему свету, устраняя необходимость в типичных инвазивных электродах, которые стимулируют нейроны, и избегая нежелательной стимуляции мышечных клеток электродами23. Эта система использует оптогенетические мотонейроны для стимуляции сокращений в неоптогенетических клетках скелетных мышц. Сочетание сбора видео и контролируемого освещения синим светом позволяет одновременно стимулировать и записывать совместно культивируемые ткани для функции NMJ.
MG вызывается аутоантителами, нацеленными на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (AChR), что приводит к снижению функции NMJ и мышечной слабости24. Он диагностируется на основе представленных симптомов, электродиагностики и обнаружения аутоантител с помощью серологических анализов крови. Тем не менее, не все аутоантитела, участвующие в МГ, были идентифицированы, и у некоторых серонегативных пациентов диагностируется МГ, но без признанных антител25,26. Наша система позволяет проводить повторную функциональную оценку NMJ до и после добавления сыворотки от пациентов с МГ, обеспечивая бесценную информацию о функциональных и биохимических изменениях, вызванных антителами MG18. Наш протокол иллюстрирует, как создавать 3D-модели in vitro функционального NMJ человека, которые могут быть использованы для диагностики и исследования патологий NMJ и тестирования потенциальных терапевтических средств. Мы демонстрируем универсальность системы на двух платформах: микрофлюидном устройстве и более крупной платформе биореактора с открытой скважиной.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта система представляет собой инженерную 3D-модель тканей человека, которая сочетает в себе оптогенетику и обработку видео, чтобы обеспечить автоматизированную и непредвзятую оценку функции NMJ. Используя стандартизированный протокол, мы продемонстрировали способность измерять изме?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с благодарностью признаем финансовую поддержку со стороны NIH [номера грантов EB025765 и EB027062], DOD [номер награды W81XWH-18-1-0095] и UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Мы с благодарностью благодарим Columbia University Stem Cell Core за их помощь и руководство по перепрограммированию клеток.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
Riferimenti
- Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
- Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
- Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
- Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
- Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Lin, C. -. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
- Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
- Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
- Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
- Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
- Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
- Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
- Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).
