Allantoic Fluid로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산
Summary
여기에서 우리는 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산, 정제 및 정량화를 위한 상세한 절차를 제공한다. 이 프로토콜은 지속적으로 > 6 × 10,9 플라크 형성 단위 / mL를 산출하여 생체 내 동물 연구에 적합한 바이러스 양을 제공합니다. 생체내 안전성을 보장하기 위한 추가의 품질 관리 분석법이 기재되어 있다.
Abstract
뉴캐슬병 바이러스(NDV)는 조류 오르토아불라바이러스 혈청형-1로도 알려져 있으며, 종양 용해 바이러스와 바이러스 벡터 백신으로 개발되어 온 부정적인 의미의 단일 가닥 RNA 바이러스입니다. NDV는 잘 정립 된 역 유전학 시스템, 강력한 면역 자극 특성 및 우수한 안전성 프로파일로 인해 매력적인 치료 및 예방제입니다. 종양 용해 바이러스 또는 바이러스 벡터 백신으로 투여 될 때, NDV는 강력한 항 종양 또는 항원 특이적 면역 반응을 유도하여 면역계의 선천적 및 적응 팔을 모두 활성화시킵니다.
이러한 바람직한 특성을 감안할 때, NDV는 수많은 임상 시험에서 평가되었으며 가장 잘 연구 된 종양 용해 바이러스 중 하나입니다. 현재 NDV와 관련된 두 가지 등록 임상 시험이 있습니다 : 하나는 SARS-CoV-2 (NCT04871737)에 대한 재조합 NDV 벡터 백신을 평가하고 두 번째는 항 PD-L1 항체 인 Durvalumab (NCT04613492)과 함께 Interleukin-12를 코딩하는 재조합 NDV를 평가하는 것입니다. 이 매우 유망한 바이러스 벡터의 추가 발전을 촉진하기 위해, 생체 등급의 고역가를 생성하기 위한 단순화된 방법, 재조합 NDV (rNDV)가 필요하다.
이 논문은 특정 병원균 프리 (SPF) 배아 닭 난자에서 rNDV를 증폭하고 동종 요법 유체에서 rNDV를 정제하는 자세한 절차를 설명하며 정화 중 손실을 줄이기위한 개선 사항을 설명합니다. 또한 오염 물질 부족 및 바이러스 무결성을 확인하기 위해 수행해야하는 권장 품질 관리 분석에 대한 설명도 포함되어 있습니다. 전반적으로,이 상세한 절차는 전임상 연구에 사용하기 위해 생체 등급, 재조합, 렌토제닉 및 메소제닉 NDV의 높은 역가의 합성, 정제 및 저장을 가능하게합니다.
Introduction
뉴캐슬병 바이러스는 조류 오르토아불라바이러스-1로도 알려져 있으며, 종양 용해 바이러스 또는 바이러스 벡터 백신 1,2,3,4,5,6,7로 사용될 가능성이 있는 외피형 조류 파라믹소바이러스이다. 가장 최근에, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 발현하도록 조작된 NDV는 마우스 및 햄스터 챌린지 모델7,8,9에서 효과적인 비내 백신으로 특성화되었다. 암 면역요법으로 사용될 때, 선천적 면역 세포, 특히 자연 살해 세포의 모집, 타입 I 인터페론의 생산, 및 항종양 특이적 T 세포10,11,12,13의 생성을 초래한다. 이러한 강력한 면역자극 특성 외에도, NDV는 강력한 안전성 프로파일과 잘 확립된 역유전학 시스템(14,15)을 갖는다. 이러한 바람직한 특성은 수많은 전임상 및 인간 임상 시험 (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17에서 NDV의 평가를 촉발시켰다. 이 매우 유망하고 면역자극성 바이러스 벡터를 더욱 발전시키기 위해서는 생체내에서 안전하게 투여될 수 있는 고역가, 초순수 NDV를 생산 및 정제하기 위한 상세한 방법이 필요하다.
NDV는 조류 파라믹소 바이러스이기 때문에 배아 된 닭 알에서 가장 자주 증폭됩니다. NDV를 전파하기 위해 이용가능한 세포 기반 시스템이 있지만, 대부분은 배아 닭 난자(18)에서 달성된 것과 유사한 역가를 생산할 수 없었다. 그럼에도 불구하고 계란 기반 생산이 길고 쉽게 확장 할 수 없다는 사실을 포함하여 계란에서 NDV를 생산하는 데는 몇 가지 단점이 있으며, 대량의 SPF 닭고기 달걀을 소싱하는 것이 문제가 될 수 있으며 계란 알레르겐 13,18,19,20으로 오염 될 가능성이 있습니다. . 최근에, 한 그룹은 무혈청 배지에서 현탁액에서 성장한 베로 세포가 정제21 이전에 계란에서 달성된 것과 유사한 역가에 대한 NDV의 복제를 지지할 수 있음을 보여주었다. 그러나, 이러한 바이러스를 베로 세포에 적응시키기 위해 바이러스의 직렬 패시징이 필요하고, 서스펜션 베로 세포로부터 NDV를 정제하는 방법의 최적화가 여전히 요구된다(21).
앞서 강조한 바와 같이, 생체 내 고역가, 생체 등급 바이러스를 정제하는 데 사용되는 방법은 질문22의 바이러스에 따라 다릅니다. 재조합 NDV의 생성에 사용할 수 있는 잘 확립된 역유전학 시스템이 있다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 cDNA 클론, 헬퍼 플라스미드, 및 헬퍼 바이러스의 사용을 수반하는 이 공정은 이전에15,23에서 상세히 기술되었다. 이 프로토콜은 렌토제닉 또는 메소제닉 NDV에 적용될 수 있다. 이 프로토콜에 기재된 바이러스는 바이러스 P와 M 유전자 사이에 삽입된 해파리 빅토리아로부터의 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 재조합 메소제닉 NDV를 개별 전사 유닛으로서 사용하며, 이는 이전에 외래 전이유전자 삽입을 위한 최적의 부위로서 기술되었기 때문에24.
동봉 된 방법은 100 ~ 500 nm의 크기와 밀도15를 기준으로 NDV의 정제를 간략하게 설명합니다. 이것은 약 3 주 내에 생체 등급의 고역가 NDV 스톡의 생성을 허용했으며, 계란이 접수 된 시점부터 최종 역가를 갖는 것까지 시작되었습니다. 접선 유동 여과, 깊이 여과 및 밀도 구배 초원심분리와 같은 계란 기반 바이러스의 대규모 생산에 자주 사용되는 기술이 설명되어 이러한 방법을 더 큰 규모의 생산으로 번역 할 수 있습니다. NDV의 정제를 위한 이전에 기술된 기술들은 바이러스-안정화 완충제의 혼입, 밀도 구배 초원심분리 동안 요오드딕사놀의 사용, 및 생체 등급 품질을 보장하기 위한 다양한 품질 관리 조치의 설명(15)에 의해 개선되었다. 이것은 0.8 내지 1.0 L의 알란토시스 유체에서 3 ×10 10 PFU/mL만큼 높은 역가에 도달하는 생체내 등급 NDV의 정제를 허용하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전임상 연구에서 치료제로 사용되는 바이러스는 생체내15 투여시 독성을 피하기 위해 고도로 정제되어야 한다. 우발적인 제제 또는 오염물질이 제거되지 않으면, 이것은 바이러스제(28)의 치료 효과를 부정하는 심각한 부작용을 초래할 수 있다. NDV는 배아 닭 난자에서 생산되기 때문에 난알부민과 같은 몇 가지 오염 된 난자 단백질이 전임상 또는 임상 모…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.G.E.Y는 온타리오 수의과 대학 박사 장학금과 온타리오 대학원 장학금을 받았습니다. 이 연구는 캐나다 디스커버리 그랜트의 자연 과학 및 공학 연구위원회가 SKW (보조금 # 304737) 및 LS (보조금 # 401127)에 자금을 지원했습니다.
Materials
| 0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
| 10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
| Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
| L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
| Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
| Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
| Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |
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