Esaminare l'effetto dei pesticidi sui neuroni caenorhabditis elegans
Summary
I nematodi caenorhabditis elegans giovani adulti sono esposti a diverse concentrazioni di pesticidi commerciali o altre sostanze tossiche per 2-24 ore. Quindi, diversi neuroni possono essere visualizzati utilizzando ceppi che esprimono fluorescenza. Questo documento dimostra come esporre i nematodi ai pesticidi e valutare il danno ai neuroni.
Abstract
Caenorhabditis elegans è un potente organismo modello utilizzato in molti laboratori di ricerca per comprendere le conseguenze dell’esposizione a inquinanti chimici, pesticidi e un’ampia varietà di sostanze tossiche. Questi nematodi sono facili da lavorare e possono essere utilizzati per generare nuovi risultati di ricerca, anche nel laboratorio di biologia universitaria. Una serie di laboratori di più settimane di progetti di ricerca autentici e guidati dagli studenti forma gli studenti in un toolkit di tecniche e approcci in misurazioni comportamentali, biologia cellulare e microscopia che poi applicano ai loro progetti. Una tecnica in quel toolkit è quantificare la percentuale di neuroni che mostrano danni neurodegenerativi a seguito dell’esposizione a un tossico chimico come un pesticida. I nematodi C. elegans giovani adulti possono essere esposti a diverse concentrazioni di pesticidi disponibili in commercio o altri tipi di sostanze tossiche per 2-24 ore. Quindi, gli studenti universitari possono visualizzare diversi sottotipi di neuroni utilizzando ceppi fluorescenti di C. elegans. Queste tecniche non richiedono sofisticati software di elaborazione delle immagini e sono efficaci anche a bassi ingrandimenti, rendendo superflua la necessità di costose microscopie confocali. Questo documento dimostra come trattare i nematodi con pesticidi e come visualizzare e segnare i neuroni. Fornisce inoltre un protocollo semplice per la microscopia e l’analisi della morfologia dei neuroni. I materiali utilizzati per questa tecnica sono economici e prontamente disponibili nella maggior parte dei dipartimenti di biologia universitari. Questa tecnica può essere combinata con misure comportamentali come la locomozione, il rallentamento basale o la deposizione delle uova per condurre una serie di esperimenti potenzialmente pubblicabili e offrire agli studenti universitari un’autentica esperienza di ricerca a un costo molto basso.
Introduction
Caenorhabditis elegans è un eccellente organismo modello per la formazione di corsi di laboratorio in corsi di scienze biologiche per studenti di livello introduttivo e intermedio. Questa procedura di laboratorio può essere utilizzata come parte di un modulo di più settimane che esplora vari effetti dei pesticidi comunemente usati sul comportamento di C. elegans e sulla biologia cellulare. Gli studenti possono imparare come progettare e realizzare progetti indipendenti che insegnano loro l’analisi dei dati e le capacità di presentazione. Questo documento si concentra sui protocolli per esporre C. elegans a miscele di pesticidi e quindi osservare e analizzare gli effetti sulla morfologia dei neuroni.
Le miscele di pesticidi chimici per prato sono ampiamente utilizzate per uso residenziale e agricolo e possono essere acquistate in qualsiasi negozio di giardinaggio locale. C’è una crescente preoccupazione per la sicurezza di queste sostanze chimiche perl’uomo e la fauna selvatica 1,2,3. Gli studenti possono leggere la letteratura scientifica e selezionare un pesticida per la valutazione sperimentale e, così facendo, possono conoscere la biologia e la neurobiologia di base, nonché importanti abilità di laboratorio come la progettazione e l’analisi sperimentale e le abilità generali di laboratorio come pipettaggio e diluizioni seriali, microscopia sezionante, microscopia fluorescente, fotografia digitale e produzione di figure.
I protocolli descritti in questo articolo possono stare da soli in un corso di livello intermedio in biologia o neuroscienze o far parte di un modulo di più settimane che potrebbe anche includere misurazioni di comportamenti governati da particolari gruppi di neuroni. Ad esempio, descritta in questo protocollo è una valutazione della morfologia dei neuroni colinergici che governano la locomozione utilizzando un ceppo di nematode che esprime GFP (LX 929) nei neuroni colinergici4. Questi ceppi possono essere ottenuti a prezzi molto bassi dal Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). I ceppi che esprimono GFP nei neuroni dopaminergici (OH 7457), nei neuroni colinergici (LX 929) o mCherry espressi in tutti i neuroni (PVX4) sono tutte buone scelte. Gli studenti potrebbero anche misurare la locomozione e ottenere dati per accompagnare la valutazione della morfologia. Una descrizione completa di un progetto di gruppo di studenti di più settimane può essere trovata in Susman5.
Questo progetto di gruppo di studenti è abbastanza economico e facile da configurare per gruppi di quattro studenti. I materiali necessari includono un microscopio di dissezione, l’accesso a un microscopio composto a fluorescenza che può avere una fotocamera digitale collegata, piastre di Petri e accesso all’agar di crescita dei nematodi, batteri con crescita limitata (ceppo OP50, dal CGC), un bruciatore Bunsen a fiamma di gas o una lampada ad alcool, un’autoclave, filo di platino e forniture di laboratorio generali come micropipetteri, vetrini per microscopi, coverslips e pipette Pasteur in vetro. A seconda del tossico chimico esaminato dai gruppi di studenti, le fasi del protocollo potrebbero dover verificarsi sotto un cappuccio di fumo o con i guanti. Questo protocollo utilizza miscele chimiche solubili in acqua (non volatili) e vengono seguite tutte le procedure di manipolazione sicura raccomandate dal produttore.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli descritti in questo manoscritto funzionano con successo da soli o come parte di un progetto di gruppo di studenti indipendenti di più settimane. I protocolli sono anche suscettibili di esperienze esplorative autonome di una settimana. I ceppi di nematodi sono economici e facili da mantenere nel laboratorio di ricerca. Gli studenti possono facilmente imparare come raccogliere i vermi con un piccone o come spostarli lavando le piastre con acqua e permettendo loro di stabilirsi per gravità. Gli esperimenti po…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato fatto per una classe di livello intermedio in neuroscienze. I fondi per i reagenti e le forniture sono stati forniti dal Dipartimento di Biologia del Vassar College. I microscopi e il sistema di imaging digitale sono stati forniti anche dal Dipartimento di Biologia del Vassar College. L’autore ringrazia tutti i numerosi studenti che hanno seguito questo corso.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
Riferimenti
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