Pestisitlerin Caenorhabditis elegans Nöronları Üzerindeki Etkisinin İncelenmesi
Summary
Genç yetişkin Caenorhabditis elegans nematodları, 2-24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda ticari pestisitlere veya diğer toksik maddelere maruz kalır. Daha sonra, floresan eksprese eden suşlar kullanılarak farklı nöronlar görselleştirilebilir. Bu makale, nematodların pestisitlere nasıl maruz bırakılacağını ve nöron hasarının nasıl değerlendirileceğini göstermektedir.
Abstract
Caenorhabditis elegans , kimyasal kirleticilere, böcek ilaçlarına ve çok çeşitli toksik maddelere maruz kalmanın sonuçlarını anlamak için birçok araştırma laboratuvarında kullanılan güçlü bir model organizmadır. Bu nematodlarla çalışmak kolaydır ve lisans biyoloji laboratuvarında bile yeni araştırma bulguları üretmek için kullanılabilir. Çok haftalık bir laboratuvar otantik, öğrenci odaklı araştırma projeleri serisi, öğrencileri davranışsal ölçümler, hücre biyolojisi ve mikroskopide daha sonra projelerine uygulayacakları bir teknik ve yaklaşım araç setinde eğitir. Bu araç setindeki bir teknik, pestisit gibi kimyasal bir toksik maddeye maruz kaldıktan sonra nörodejeneratif hasar gösteren nöronların yüzdesini ölçmektir. Genç yetişkin C. elegans nematodları, 2-24 saat boyunca ticari olarak temin edilebilen pestisitlerin veya diğer toksik maddelerin farklı konsantrasyonlarına maruz kalabilir. Daha sonra, lisans öğrencileri C. elegans’ın floresan eksprese eden suşlarını kullanarak farklı nöron alt tiplerini görselleştirebilirler. Bu teknikler sofistike görüntü işleme yazılımı gerektirmez ve düşük büyütmelerde bile etkilidir, bu da pahalı konfokal mikroskopiye olan ihtiyacı gereksiz kılar. Bu makale, nematodların pestisitlerle nasıl tedavi edileceğini ve nöronların nasıl görüntüleneceğini ve puanlanacağını göstermektedir. Ayrıca mikroskopi ve nöron morfolojisinin analizi için basit bir protokol sağlar. Bu teknik için kullanılan malzemeler ucuzdur ve çoğu lisans biyoloji bölümünde kolayca bulunabilir. Bu teknik, potansiyel olarak yayınlanabilir bir dizi deney yapmak ve lisans öğrencilerine çok düşük bir maliyetle otantik bir araştırma deneyimi sunmak için hareket, bazal yavaşlama veya yumurtlama gibi davranışsal önlemlerle birleştirilebilir.
Introduction
Caenorhabditis elegans , giriş ve orta düzey öğrenciler için biyolojik bilim derslerinde laboratuvar dersi eğitimi için mükemmel bir model organizmadır. Bu laboratuvar prosedürü, yaygın olarak kullanılan pestisitlerin C. elegans davranışı ve hücre biyolojisi üzerindeki çeşitli etkilerini araştıran çok haftalık bir modülün parçası olarak kullanılabilir. Öğrenciler, kendilerine veri analizi ve sunum becerilerini öğreten bağımsız projelerin nasıl tasarlanacağını ve yürütüleceğini öğrenebilirler. Bu yazıda, C. elegans’ın pestisit karışımlarına maruz bırakılması ve daha sonra nöron morfolojisi üzerindeki etkilerin gözlemlenmesi ve analiz edilmesi için protokoller üzerinde durulmaktadır.
Çim kimyasal pestisit karışımları konut ve tarımsal kullanım için yaygın olarak kullanılmaktadır ve herhangi bir yerel bahçe mağazasından satın alınabilir. Bu kimyasalların insanlar ve vahşi yaşam için güvenliği konusunda artan endişeler var 1,2,3. Öğrenciler bilimsel literatürü okuyabilir ve deneysel değerlendirme için bir pestisit seçebilir ve bunu yaparken temel biyoloji ve nörobiyolojinin yanı sıra deneysel tasarım ve analiz gibi önemli laboratuvar becerileri ve pipetleme ve seri seyreltme, disseksiyon mikroskobu, floresan mikroskopi, dijital fotoğrafçılık ve şekil üretimi gibi genel laboratuvar becerileri hakkında bilgi edinebilirler.
Bu makalede açıklanan protokoller, biyoloji veya sinirbilimde orta düzey bir derste tek başına durabilir veya belirli nöron grupları tarafından yönetilen davranışların ölçümlerini de içerebilen çok haftalık bir modülün parçası olabilir. Örneğin, bu protokolde tanımlanan, kolinerjik nöronlarda GFP’yi (LX 929) eksprese eden bir nematod suşu kullanarak hareketi yöneten kolinerjik nöronların morfolojisinin bir değerlendirmesidir4. Bu suşlar Caenorhabditis elegans Genetik Merkezi’nden (https://cgc.umn.edu/) çok düşük fiyatlarla elde edilebilir. Dopaminerjik nöronlarda GFP’yi ifade eden suşlar (OH 7457), kolinerjik nöronlar (LX 929) veya tüm nöronlarda (PVX4) eksprese edilen mCherry iyi seçimlerdir. Öğrenciler ayrıca hareket kabiliyetini ölçebilir ve morfolojinin değerlendirilmesine eşlik edecek veriler elde edebilirler. Çok haftalık bir öğrenci grubu projesinin tam bir açıklaması Susman5’te bulunabilir.
Bu öğrenci grubu projesi, dört öğrenciden oluşan gruplar için oldukça ucuz ve kurulumu kolaydır. İhtiyaç duyulan malzemeler arasında diseksiyon mikroskobu, ekli bir dijital kameraya sahip olabilen bir floresan bileşik mikroskobuna erişim, Petri plakaları ve nematod büyüme agarına erişim, büyüme sınırlı bakteriler (CGC’den OP50 suşu), bir gaz alevli Bunsen brülörü veya bir alkol lambası, bir otoklav, platin tel ve mikropipetleyiciler, mikroskop slaytları gibi genel laboratuvar malzemeleri, kapaklar ve cam Pasteur pipetler. Öğrenci grupları tarafından incelenen kimyasal toksik maddeye bağlı olarak, protokoldeki adımların bir duman başlığı altında veya eldivenlerle gerçekleşmesi gerekebilir. Bu protokol, suda çözünür (uçucu olmayan) kimyasal karışımlar kullanır ve üretici tarafından önerilen tüm güvenli taşıma prosedürleri izlenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede açıklanan protokoller tek başına veya çok haftalık bağımsız öğrenci grubu projesinin bir parçası olarak başarılı bir şekilde çalışmaktadır. Protokoller ayrıca bağımsız, bir haftalık keşif deneyimlerine de uygundur. Nematod suşları araştırma laboratuvarında ucuz ve bakımı kolaydır. Öğrenciler, solucan toplama ile solucanların nasıl toplanacağını veya plakaları suyla yıkayarak ve yerçekimi ile yerleşmelerine izin vererek onları nasıl hareket ettireceklerini kolayc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makalede açıklanan çalışma, sinirbilimde orta düzey bir sınıf için yapılmıştır. Reaktifler ve malzemeler için fonlar Vassar Koleji Biyoloji Bölümü tarafından sağlandı. Mikroskoplar ve dijital görüntüleme sistemi de Vassar Koleji Biyoloji Bölümü tarafından sağlandı. Yazar, bu dersi alan tüm öğrencilere teşekkür eder.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
Riferimenti
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
- Susman, K. . Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
- Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).
