Undersøgelse af virkningen af pesticider på Caenorhabditis elegans neuroner

Summary

Unge voksne Caenorhabditis elegans nematoder udsættes for forskellige koncentrationer af kommercielle pesticider eller andre toksiske stoffer i 2-24 timer. Derefter kan forskellige neuroner visualiseres ved hjælp af fluorescerende ekspressionerende stammer. Dette papir viser, hvordan man udsætter nematoder for pesticider og vurderer neuronskader.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en kraftfuld modelorganisme, der anvendes i mange forskningslaboratorier til at forstå konsekvenserne af eksponering for kemiske forurenende stoffer, pesticider og en lang række giftige stoffer. Disse nematoder er nemme at arbejde med og kan bruges til at generere nye forskningsresultater, selv i bachelorbiologilaboratoriet. En flerugers laboratorieserie af autentiske, studenterdrevne forskningsprojekter træner eleverne i et værktøjssæt af teknikker og tilgange inden for adfærdsmålinger, cellebiologi og mikroskopi, som de derefter anvender på deres projekter. En teknik i dette værktøjssæt er at kvantificere procentdelen af neuroner, der udviser neurodegenerativ skade efter eksponering for et kemisk toksisk stof som et pesticid. Unge voksne C. elegans nematoder kan udsættes for forskellige koncentrationer af kommercielt tilgængelige pesticider eller andre typer toksiske stoffer i 2-24 timer. Derefter kan bachelorstuderende visualisere forskellige neuronundertyper ved hjælp af fluorescerende ekspresserende stammer af C. elegans. Disse teknikker kræver ikke sofistikeret billedbehandlingssoftware og er effektive ved selv lave forstørrelser, hvilket gør behovet for dyr konfokal mikroskopi unødvendigt. Dette papir viser, hvordan man behandler nematoderne med pesticider, og hvordan man afbilder og scorer neuronerne. Det giver også en ligetil protokol til mikroskopi og analyse af neuronmorfologi. De materialer, der anvendes til denne teknik, er billige og let tilgængelige i de fleste bachelorbiologiske afdelinger. Denne teknik kan kombineres med adfærdsmæssige foranstaltninger som bevægelse, basal opbremsning eller æglægning for at gennemføre en potentielt publicerbar række eksperimenter og give bachelorstuderende en autentisk forskningsoplevelse til en meget lav pris.

Introduction

Caenorhabditis elegans er en fremragende modelorganisme til laboratoriekursusuddannelse i biologiske videnskabskurser for introduktions- og mellemniveaustuderende. Denne laboratorieprocedure kan bruges som en del af et flerugers modul, der udforsker forskellige virkninger af almindeligt anvendte pesticider på C. elegans adfærd og cellebiologi. Studerende kan lære at designe og gennemføre uafhængige projekter, der lærer dem dataanalyse og præsentationsfærdigheder. Dette papir fokuserer på protokollerne til udsættelse af C. elegans for pesticidblandinger og derefter observere og analysere virkningerne på neuronmorfologi.

Græsplæne kemiske pesticidblandinger anvendes i vid udstrækning til bolig- og landbrugsbrug og kan købes hos enhver lokal havebutik. Der er stigende bekymring for sikkerheden af disse kemikalier for mennesker og dyreliv ^1,2,3. Studerende kan læse den videnskabelige litteratur og vælge et pesticid til eksperimentel evaluering og kan dermed lære om grundlæggende biologi og neurobiologi samt vigtige laboratoriefærdigheder som eksperimentelt design og analyse og generelle laboratoriefærdigheder som pipettering og serielle fortyndinger, dissekering af mikroskopi, fluorescerende mikroskopi, digital fotografering og figurproduktion.

De protokoller, der er beskrevet i dette papir, kan stå alene i et mellemliggende kursus i biologi eller neurovidenskab eller være en del af et flere ugers modul, der også kan omfatte målinger af adfærd styret af bestemte grupper af neuroner. For eksempel er beskrevet i denne protokol en vurdering af morfologien af kolinerge neuroner, der styrer bevægelse ved hjælp af en stamme af nematode, der udtrykker GFP (LX 929) i kolinerge neuroner⁴. Disse stammer kan fås til meget lave priser fra Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Stammer, der udtrykker GFP i dopaminerge neuroner (OH 7457), kolinerge neuroner (LX 929) eller mCherry udtrykt i alle neuroner (PVX4) er alle gode valg. Studerende kunne også måle bevægelse og få data til at ledsage vurderingen af morfologi. En fuldstændig beskrivelse af et flerugers studentergruppeprojekt findes i Susman⁵.

Dette studentergruppeprojekt er ret billigt og let at oprette for grupper på fire studerende. De nødvendige materialer omfatter et dissekeringsmikroskop, adgang til et fluorescensforbindelsesmikroskop, der kan have et vedhæftet digitalkamera, Petri-plader og adgang til nematodevækstar, vækstbegrænsede bakterier (stamme OP50, fra CGC), en gasflamme Bunsen-brænder eller en alkohollampe, en autoklave, platintråd og generelle laboratorieforsyninger som mikropipettere, mikroskopdias, dæksedler og pasteurpipetter af glas. Afhængigt af det kemiske toksiske stof, der undersøges af elevgrupperne, skal trinene i protokollen muligvis forekomme under en stinkhætte eller med handsker. Denne protokol bruger kemiske blandinger, der er vandopløselige (ikke flygtige), og alle sikre håndteringsprocedurer, der anbefales af producenten, følges.

Protocol

Al brug af hvirvelløse dyr var i overensstemmelse med institutionens retningslinjer for dyrepleje og brug. 1. Fremstilling af pesticidbelagte Petri-plader Forbered agar Petriskåle (6 cm diameter fungerer bedst) ved hjælp af standardprocedurer6.BEMÆRK: Disse kan laves måneder i forvejen og opbevares i køleskabet indtil brug. Bring pladerne til stuetemperatur (RT) på bordpladen. I de fleste tilfælde skal elevgrupperne forsynes med en…

Representative Results

De metoder og protokoller, der er beskrevet i dette papir, giver vigtige laboratoriefærdigheder til bachelorstuderende på mellemniveau i biologi eller neurovidenskab. Studerende kan få vigtig erfaring med at udvikle et uafhængigt projekt og gennemføre et eksperiment af deres eget design, der kan give nye resultater. Figur 3 viser et optimalt resultat af et studenterprojekt, der til sidst blev en del af en publiceret opgave3. Mens de fleste elevprojekter ikke resu…

Discussion

De protokoller, der er beskrevet i dette manuskript, fungerer med succes alene eller som en del af et fler ugers uafhængigt studentergruppeprojekt. Protokollerne er også modtagelige for enkeltstående, en uges sonderende oplevelser. Nematodestammerne er billige og nemme at vedligeholde i forskningslaboratoriet. Studerende kan let lære at plukke orme med en ormplukning eller hvordan man flytter dem ved at skylle plader med vand og lade dem slå sig ned ved tyngdekraften. Eksperimenterne kan udføres i løbet af en enke…

Materials

Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250