Summary
Deze procedure beschrijft een vertaalbaar progressief belast loopwielweerstandstrainingsmodel bij muizen. Het belangrijkste voordeel van dit weerstandstrainingsmodel is dat het volledig vrijwillig is, waardoor stress voor de dieren en de belasting voor de onderzoeker wordt verminderd.
Abstract
Eerder ontwikkelde op knaagdierresistentie gebaseerde trainingsmodellen, waaronder synergetische ablatie, elektrische stimulatie, klimmen op een gewogen ladder en meest recent, gewogen sleetrekken, zijn zeer effectief in het bieden van een hypertrofische stimulus om skeletspieraanpassingen te induceren. Hoewel deze modellen van onschatbare waarde zijn gebleken voor skeletspieronderzoek, zijn ze invasief of onvrijwillig en arbeidsintensief. Gelukkig lopen veel knaagdierstammen vrijwillig lange afstanden wanneer ze toegang krijgen tot een loopwiel. Loaded wheel running (LWR) -modellen bij knaagdieren zijn in staat om aanpassingen te induceren die vaak worden waargenomen met weerstandstraining bij mensen, zoals verhoogde spiermassa en vezelhypertrofie, evenals stimulatie van spiereiwitsynthese. De toevoeging van matige wielbelasting kan muizen echter niet afschrikken om grote afstanden te lopen, wat meer een weerspiegeling is van een uithoudingsvermogen / weerstandstrainingsmodel, of de muizen stoppen bijna volledig met rennen vanwege de methode van belastingstoepassing. Daarom is een nieuw high-load wielloopmodel (HLWR) ontwikkeld voor muizen waarbij externe weerstand wordt toegepast en geleidelijk wordt verhoogd, waardoor muizen kunnen blijven rennen met veel hogere belastingen dan eerder werd gebruikt. Voorlopige resultaten van dit nieuwe HLWR-model suggereren dat het voldoende stimulans biedt om hypertrofische aanpassingen te induceren gedurende het trainingsprotocol van 9 weken. Hierin worden de specifieke procedures beschreven om dit eenvoudige maar goedkope progressieve weerstandsgebaseerde trainingsmodel bij muizen uit te voeren.
Introduction
Skeletspiermassa omvat ongeveer 40% van de lichaamsmassa bij volwassen mensen; daarom is het behoud van skeletspiermassa gedurende het hele leven van cruciaal belang. Skeletspiermassa speelt een integrale rol bij het energiemetabolisme, het handhaven van de kerntemperatuur van het lichaam en glucosehomeostase1. Het onderhoud van de skeletspieren is een balans tussen eiwitsynthese en eiwitafbraak, maar er zijn nog steeds veel hiaten in het begrip van de ingewikkelde moleculaire mechanismen die deze processen aandrijven. Om de moleculaire mechanismen te bestuderen die het onderhoud en de groei van spiermassa reguleren, maken de onderzoeksmodellen van menselijke proefpersonen vaak gebruik van op weerstandsoefeningen gebaseerde interventies, omdat mechanische stimuli een integrale rol spelen bij de regulatie van skeletspiermassa. Hoewel het onderzoek van menselijke proefpersonen succesvol is geweest, beperkt de tijd die nodig is om aanpassingen en ethische zorgen met betrekking tot invasieve procedures (d.w.z. spierbiopten) te vertonen, de hoeveelheid gegevens die kan worden verkregen. Hoewel de aanpassingen aan weerstandsoefeningen vrij alomtegenwoordig zijn bij zoogdiersoorten, bieden diermodellen het voordeel dat ze het dieet en het trainingsregime nauwkeurig kunnen beheersen, terwijl ze ook de verzameling van hele weefsels door het hele lichaam mogelijk maken, zoals de hersenen, lever, hart en skeletspieren.
Veel weerstandstrainingsmodellen zijn ontwikkeld voor gebruik bij knaagdieren: synergetische ablatie2, elektrische stimulatie 3,4, gewogen ladderklimmen5,verzwaarde slee trekken 6 en canvassed squatting7. Het is duidelijk dat al deze modellen, indien correct uitgevoerd, effectieve modellen kunnen zijn om skeletspieraanpassingen, zoals hypertrofie, te induceren. De nadelen van deze modellen zijn echter dat ze meestal onvrijwillig zijn, geen deel uitmaken van normaal knaagdiergedrag, tijd- / arbeidsintensief en invasief.
Gelukkig lopen veel muizen- en rattensoorten vrijwillig lange afstanden wanneer ze toegang krijgen tot een loopwiel. Bovendien vertrouwen free-running wheel (FWR) trainingsmodellen niet op uitgebreide conditionering, positieve / negatieve versterking of anesthesie om beweging of spieractiviteit te forceren 8,9. Hardloopactiviteit is sterk afhankelijk van de stam van de muis, het geslacht, de leeftijd en een individuele basis. Lightfoot et al. vergeleken de loopactiviteit van 15 verschillende muizenstammen en ontdekten dat de dagelijkse hardloopafstand varieert van 2,93 km tot 7,93 km, waarbij C57BL / 6-muizen het verst rennen, ongeacht geslacht10. FWR wordt algemeen aanvaard als een uitstekend model voor het induceren van uithoudingsvermogen aanpassingen in skelet- en hartspieren 11,12,13,14,15,16; het gebruik van wiellopen in weerstandstrainingsmodellen wordt echter minder vaak onderzocht.
Zoals men zou kunnen vermoeden, kan het hypertrofische effect van wiellopen worden versterkt door weerstand toe te voegen aan het loopwiel, genaamd loaded wheel running (LWR), waardoor grotere inspanningen nodig zijn om op het wiel te lopen om weerstandstraining beter na te bootsen. Met behulp van verschillende methoden voor het aanbrengen van belasting hebben eerdere studies aangetoond dat het LWR-model met ratten en muizen routinematig een toename van de spiermassa van ledematen van 5% -30% vertoonde in een kwestie van 6-8 weken 17,18,19,20,21. Bovendien toonden D'hulst et al. aan dat een enkele aanval van LWR leidde tot een 50% grotere toename van de activering van de signaalroute van eiwitsynthese in vergelijking met FWR22. Wielweerstand is meestal toegepast door een op wrijving gebaseerde, constante belastingsmethode, waarbij een magnetische rem of spanbout wordt gebruikt om wielweerstand 12,19,23,24 toe te passen. Een kanttekening bij de op wrijving gebaseerde, constante belastingsmethode is dat wanneer matige tot hoge weerstand wordt toegepast, het dier de hoge weerstand niet kan overwinnen om beweging van het wiel te initiëren, waardoor de training effectief wordt stopgezet. Het belangrijkste is dat veel van de kooi- en wielsystemen die worden gebruikt voor knaagdierloopwielmodellen vrij duur zijn en gespecialiseerde apparatuur vereisen.
Onlangs ontwikkelden Dungan et al. een progressief gewogen wiellopend (PoWeR) model, dat asymmetrisch een belasting op het wiel uitoefent via externe massa's die aan een enkele kant van het wiel zijn gehecht. De onevenwichtige wielbelasting en variabele weerstand van het PoWeR-model worden verondersteld om voortdurende loopactiviteit aan te moedigen en kortere uitbarstingen van geladen wiellopen bij muizen te bevorderen, waarbij de sets en herhalingen die worden uitgevoerd met weerstandstrainingnauwer worden nagebootst 17. Ondanks dat de gemiddelde hardloopafstand 10-12 km per dag was, leverde het PoWeR-model een toename van respectievelijk 16% en 17% op in plantaris spier natte massa en vezeldoorsnedegebied (CSA). Ondanks veel praktische voordelen heeft het PoWeR-model van LWR enkele beperkingen. Zoals erkend door de auteurs, is het PoWeR-model een "hybride" stimulus met een hoog volume die een weerspiegeling is van een gemengd duur/ weerstandsoefeningsmodel (d.w.z. gelijktijdige training bij mensen), in tegenstelling tot een strikter op weerstandsoefeningen gebaseerd model, dat mogelijk een interferentie-effect introduceert en bijdraagt aan de minder uitgesproken hypertrofie of verschillende mechanismen waardoor hypertrofie wordt geïnduceerd25 . Ervoor zorgen dat een gelijktijdig trainingsfenomeen niet optreedt in wat bedoeld is als een weerstandstrainingsmodel, is absoluut noodzakelijk. Daarom werd het PoWeR-model aangepast om een LWR-model te ontwikkelen dat hogere belastingen gebruikt dan eerder werd gebruikt om meer op een weerstandstrainingsmodel te lijken. Hierin worden details gegeven voor een eenvoudig en goedkoop 9 weken durende progressieve weerstandstraining LWR-model in C57BL / 6-muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Appalachian State University (# 22-05).
1. Dieren
- Koop C57BL/6-muizen uit de eigen muizenkolonie.
OPMERKING: Mannelijke muizen van 5-8 maanden oud aan het begin van het onderzoek werden gebruikt. Dagelijkse hardloopactiviteit piekt en plateaus rond 9-10 weken oud26. Eerdere studies hebben aangetoond dat oude muizen (22-24 maanden) ook belaste wielloop27 zullen uitvoeren. - Huisvest de muizen individueel in een standaard knaagdierkooi met een draaddeksel en houd de kooi in een gecontroleerde omgeving (20-24 °C met een licht-/donkercyclus van 12:12 uur).
- Zorg voor standaard knaagdier chow en water ad libitum.
2. Loopwielapparatuur
- Hardloopwiel setup:
OPMERKING: Loopwielen worden op dezelfde manier geassembleerd/ingesteld voor alle loopprotocollen, met uitzondering van het toevoegen van 1 g of 2,5 g belastingsmagneten.- Lijm een enkele sensormagneet van 1 g op de buitenste middelste omtrek van het loopwiel (figuur 1).
- Gebruik dit wiel met een enkele sensormagneet van 1 g voor alleen de eerste week van de acclimatisatie van het wiel.
- Loaded wheel running (LWR; identiek laadprotocol als PoWeR17): Volg de stappen 2.1.4-2.1.6.
- Week 2 voor LWR vereist 2 g belasting (zie tabel 1).
- Lijm twee magneten van 1 g naast elkaar op de buitenomtrek van het wiel (figuur 2A).
OPMERKING: Hier is het handig om tape te gebruiken om de magneten op hun plaats te houden totdat de lijm stevig droogt; anders kunnen ze worden aangetrokken door de sensormagneet en losraken. - Breng extra belasting aan in week 3, 4 en 6 door nog een magneet van 1 g op een van de reeds aanwezige magneten te plaatsen.
OPMERKING: Er is geen lijm nodig omdat de magneten stevig aan elkaar hechten. Bij 6 g belasting in week 6 worden de magneten bijvoorbeeld elk driehoog gestapeld (figuur 2B). - Hoogbelaste wielloop (HLWR): Volg de stappen 2.1.8-2.1.11.
OPMERKING: Het HLWR-protocol vereist drie sets wielen. Door verschillende sets wielen samen te stellen, kan de onderzoeker wielopstellingen voor andere muizen hergebruiken zodra het wiel grondig is gereinigd en ontsmet (aantallen van elke set moeten door de onderzoeker worden bepaald op basis van cohort / groepsgrootte). - De eerste set wielen (alleen vereist voor week 2) heeft een enkele magneet van 2,5 g; lijm (zie de OPMERKING hieronder stap 2.1.5) één magneet van 2,5 g op de buitenomtrek van het wiel (figuur 3A).
- De tweede set wielen (alleen vereist voor week 3) heeft twee magneten van 2,5 g; lijm (zie de OPMERKING hieronder stap 2.1.5) twee magneten van 2,5 g naast elkaar op de buitenomtrek van het wiel (figuur 3B).
- De derde set wielen (vereist voor week 4 en daarna) heeft drie magneten van 2,5 g naast elkaar; lijm (zie de OPMERKING hieronder stap 2.1.5) drie magneten van 2,5 g naast elkaar op de buitenomtrek van het wiel (figuur 3C).
- Breng extra belasting aan gedurende week 6 en 8 door nog een magneet van 2,5 g op een van de reeds aanwezige magneten te plaatsen (figuren 3D, E).
Figuur 1: Basis loopwiel met enkele 1 g sensormagneet gelijmd op de middelste buitenomtrek van het wiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Belast loopwiel (LWR) met sensormagneet en 1 g laadmagneten. (A) Voorbeeld van 2 g belasting, twee magneten van 1 g die naast elkaar aan de buitenrand van het wiel zijn gelijmd; (B) voorbeeld van 6 g belasting, twee magneten van 1 g die naast elkaar op de buitenrand van het wiel zijn gelijmd met een extra belasting van 4 g. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Hoogbelast loopwiel (HLWR) met sensormagneet en 2,5 g laadmagneten. (A) voorbeeld van 2,5 g belasting, één magneet van 2,5 g gelijmd aan de buitenrand van het wiel; B) voorbeeld van 5 g belasting, twee magneten van 2,5 g die naast elkaar aan de buitenrand van het wiel zijn gelijmd; C) voorbeeld van 7,5 g belasting, drie magneten van 2,5 g die naast elkaar op de buitenrand van het wiel zijn gelijmd; D) voorbeeld van 10 g belasting, drie magneten van 2,5 g die naast elkaar aan de buitenrand van het wiel zijn gelijmd, met een extra belasting van 2,5 g; (E) voorbeeld van 12,5 g belasting, drie magneten van 2,5 g die naast elkaar aan de buitenrand van het wiel zijn gelijmd, met nog eens 5 g belasting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Kooi montage
- Monteer loopwielen met behulp van een kooi uitgerust met een digitale fietscomputer om de tijdoefening (h) en de afgelegde afstand (km) te controleren. De gemiddelde snelheid (km/h) wordt rekenkundig afgeleid.
- Zorg ervoor dat er een nieuwe batterij in de fietscomputer wordt geplaatst voordat deze wordt gemonteerd.
- Stel de wielmaat in tijdens de eerste fietscomputerprogrammering (zie de instructies van de fabrikant); bereken de omwentelingsafstand door de buitenomtrek van het loopwiel te meten (bijv. 3.580 mm voor het hierin gebruikte wieltype).
- Plaats de fietscomputersensor op een vast oppervlak aan de buitenkant van het deksel van de kooi, direct boven waar de sensormagneet van het wiel zich bevindt. Zorg ervoor dat alle computer- en sensorcomponenten zich binnen een vaste barrière buiten de kooi bevinden om te voorkomen dat muizen op componenten kauwen.
- Gebruik het deksel van een lege pipetpuntendoos met een kleine rechthoek uitgesneden voor de magnetische fietssensor om te verblijven, en het grootste deel van de doos (met het tiprekrooster verwijderd) om de fietscomputer en de draad vast te houden (figuur 4A).
- Boor twee gaten door de hoeken van het vaste oppervlak om de magnetische fietssensor en de loopwielstandaard aan de buitenkant van de kooi op hun plaats te houden (figuur 4A).
- Steek de basis van het loopwiel ondersteboven door de openingen in het deksel van de kooi, maar bovenop het vaste oppervlak zoals beschreven in stap 3.2 (figuur 4B).
- Bevestig de wielbasis en de computersensor aan de bovenkant van de kooi met hardware (figuur 4C, D).
- Zorg ervoor dat de sensormagneet en de computersensor niet meer dan 1 cm uit elkaar staan om een goede registratie van wielbewegingen mogelijk te maken (de meeste standaard fietscomputersensoren zijn bidirectioneel en registreren positieve wielbewegingen in beide draairichtingen).
- Bevestig het juiste loopwiel (zoals hierboven beschreven) aan de wielbasis vanaf de binnenkant van het deksel van de kooi en plaats het deksel stevig op de kooi (figuur 4E, F).
- Met het wiel hangend aan het deksel van de kooi, zorg voor ten minste 2,5 cm speling van de kooivloer. Plaats een minimale hoeveelheid strooiselmateriaal in de kooi om ervoor te zorgen dat het wiel vrij ronddraait, maar niet wordt belemmerd door de opeenhoping van beddengoed.
- Leg tijdens het experimenteren gegevens van de fietscomputer vast met een consistent intervalschema om nauwkeurige activiteitsmonitoring te garanderen.
- Erken dat muizen een nachtactieve soort zijn; daarom zal het grootste deel van hun natuurlijke kooiactiviteit (inclusief wiellopen) worden uitgevoerd tijdens de donkere uren van de lichtcyclus.
Figuur 4: Hardloopwielkooi. (A) Fietscomputer en magnetische sensor geplaatst in een vast oppervlak/bakje; B) omgekeerde wielbasis bovenop een vast oppervlak/lade en sensor (bovenaanzicht; let op de twee gaten in het sensoroppervlak/de sensorlade voor het bevestigen van de basis aan het deksel van de kooi met hardware), (C) omgekeerde wielbasis met hardware gemonteerd (onderste weergave); D) omgekeerde wielbasis met hardware gemonteerd (bovenaanzicht); (E) volledige kooiassemblage (bovenaanzicht); en (F) volledige kooiassemblage (zijaanzicht). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Trainingstraining laadprotocollen
- Huisvest individueel sedentaire (SED) muizen gedurende 9 weken in een kooi met een vergrendeld loopwiel om rennen te voorkomen.
OPMERKING: Tabel 1 geeft het laadschema voor de LWR (PoWeR) en HLWR-protocollen die in het experimentele ontwerp worden gebruikt. - Verminder de belasting voor de LWR- en HLWR-groepen, indien nodig, om ervoor te zorgen dat muizen gedurende het hele protocol van 9 weken blijven oefenen.
| Week | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ||
| LWR (n = 4) | Belasting (g) | 0.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 5.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0 |
| %BM | -- | 8% | 11% | 15% | 19% | 19% | 23% | 23% | 23% | |
| HLWR (n = 7) | Belasting (g) | 0.0 | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 7.5 | 10.0 | 10.0 | 12.5 | 12.5 |
| %BM | -- | 10% | 19% | 28% | 28% | 38% | 38% | 48% | 48% | |
Tabel 1. Protocollen voor belaste wielloop
5. In situ spierfunctietesten, weefseloogst en weefselanalyse
- Na de trainingsinterventie van 9 weken verdooft u muizen met behulp van geïnhaleerd isofluraan (4% inductie; 2% onderhoud) met aanvullende zuurstof en zorgt u voor een goede anesthetische vliegtuigbewaking gedurende de hele procedure.
- Voer een in situ spierfunctietest uit op het gastrocnemius,plantaris, soleus (GPS) complex om isometrische spierkracht te testen28. Stel een kracht-frequentiecurve vast door de heupzenuw direct te stimuleren met 27 G elektrodenaalden bij 11 oplopende frequenties tussen 1-300 Hz, waarbij tetanische contracties optreden rond 100-150 hz29.
- Onmiddellijk na de spierfunctietest, euthanaseer de muizen via cervicale dislocatie en bevestig euthanasie door het hart te verwijderen. Snijd de plantaris- en soleusspieren zorgvuldig weg en noteer de natte weefselmassa.
- Bekleed elk spiermonster in een insluitmedium (OCT) en monteer het op een kurk. Vries het in vloeibare stikstofgekoelde isopentaan en bewaar het bij -80 °C totdat verdere immunohistochemische (IHC) analyse wordt uitgevoerd op delen van spierweefsel (10 μm dik).
- Analyseer spiervezel CSA met behulp van immunofluorescentie voor laminine. Meet vezel CSA met behulp van een automatisch beeldkwantificeringsplatform30.
6. Statistische analyse
- Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± SD.
- Voer statistische analyses uit met behulp van statistische analysesoftware met een significantie ingesteld op p ≤ 0,05.
- Vergelijk wielloop- en trainingsvolumegegevens met herhaalde metingen in twee richtingen ANOVA.
- Vergelijk lichaamsmassa, weefselmassa, CSA en spierfunctie met een eenrichtings-ANOVA. Als significante F-ratio's worden gevonden, vergelijk dan verschillen binnen de groep met behulp van Fisher LSD post hoc analyses.
- Bereken effectgrootten en interpreteer ze vervolgens als 0,01, 0,06 en 0,14 voor respectievelijk kleine, middelgrote en grote effectgrootten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werden 24 C57BL/6 muizen (6,3 ± 0,7 maanden aan het begin van deze studie) willekeurig toegewezen aan een van de drie behandelingsgroepen: sedentair (SED), geladen wiellopen (LWR; hetzelfde als PoWeR beschreven door Dungan et al.17), of hoge LWR (HLWR), en voltooiden vervolgens hun respectieve 9 weken protocol. Na de acclimatisatieweek (week 1) waren er geen groeps- of groep x tijdsverschillen in loopafstand of trainingsvolume (figuur 5).
Figuur 5: Eigenschappen van het loopwiel voor de groepen LWR (groen gevulde vierkanten) en HLWR (rood gevulde driehoeken). (A) Gemiddelde dagelijkse rijafstand (km); B) gemiddeld trainingsvolume (km/dag∙g), uitgedrukt als dagelijkse loopafstand (km/dag) vermenigvuldigd met de dagelijkse wielbelasting (in g). De gegevens worden uitgedrukt als groepgemiddelde ± SD. LWR, n = 4; HLWR, n = 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De genormaliseerde soleusmassa was 21,4% groter in de HLWR-groep dan de SED-groep (p < 0,001), ondanks geen verschil in vezel-CSA (p = 0,536) (figuur 6A). Hoewel plantaris spiermassa en gemiddelde vezel CSA geen statistisch significante verschillen vertoonden (respectievelijk p = 0,573 en p = 0,111), lijkt er een verschuiving te zijn in het aandeel vezels met een grotere CSA in de plantaris van HLWR, vergeleken met SED en LWR (figuur 6B). Er waren geen significante verschillen in spiertrekking of piekkracht van het GPS-complex tussen groepen zoals gemeten door een in situ spierfunctietest (tabel 2).
Figuur 6: Vezeldoorsnede gebied verhoudingen. (A) Soleus en (B) plantaris spiervezel verhoudingen (%) door dwarsdoorsnede voor SED (zwart gevulde cirkels), LWR (groen gevulde vierkanten) en HLWR (rood gevulde driehoeken) groepen (n = 3-4/groep). De soleusspier bevat vergelijkbare vezel CSA-verhoudingen in alle groepen. De plantarisspier van de HLWR-groep lijkt een hoger aandeel vezels te hebben met grotere CSA, vergeleken met SED- en LWR-groepen. Gegevens worden uitgedrukt als groepgemiddelde voor elke vezelgroottecategorie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Groep | |||||
| SED | LWR | Hlwr | P-waarde | Effectgrootte (ƞ2) | |
| Lichaamsmassa voorafgaand aan de training (g) | 26,35 ± 2,12 | 28,07 ± 3,42 | 25,71 ± 2,22 | 0.299 | 0.324 |
| Lichaamsmassa na de training (g) | 26,82 ± 1,96 | 28,91 ± 2,80 | 27,43 ± 2,07 | 0.251 | 0.341 |
| Soleusmassa (mg/g BM) | 0,28 ± 0,03 | 0,31 ± 0,02 | 0,34 ± 0,03# | 0.003 | 0.611 |
| Plantaris massa (mg/g BM) | 0,61 ± 0,06 | 0,64 ± 0,03 | 0,63 ± 0,06 | 0.573 | 0.239 |
| Soleus CSA (μm²) | 2042 ± 320 | 1964 ± 357 | 1800 ± 206 | 0.536 | 0.130 |
| Plantaris CSA (μm²) | 2032 ± 159 | 2483 ± 579 | 2754 ± 109 | 0.111 | 0.519 |
| Twitch-kracht (N / g GPS) | 2,96 ± 0,47 | 3,19 ± 0,58 | 3,42 ± 0,78 | 0.254 | 0.340 |
| Maximale tetanische kracht (N/g GPS) | 11,43 ± 1,77 | 13,04 ± 2,87 | 13,13 ± 1,70 | 0.136 | 0.395 |
| # - geeft aan dat het anders is dan SED; Effectgrootte (ƞ2): klein = 0,01; gemiddeld = 0,06; groot = 0,140 | |||||
Tabel 2. Dierlijke kenmerken, weefselmassa, spierkracht en vezeldoorsnede
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestaande weerstandsoefeningsmodellen bij knaagdieren zijn van onschatbare waarde gebleken voor skeletspieronderzoek; veel van deze modellen zijn echter invasief, onvrijwillig en / of tijd- en arbeidsintensief. LWR is een uitstekend model dat niet alleen vergelijkbare spieraanpassingen induceert als die waargenomen in andere goed geaccepteerde weerstandstrainingsmodellen, maar ook een chronische, stressarme trainingsstimulans voor het dier biedt met minimale tijd / arbeidsinzet door de onderzoeker. Bovendien, omdat LWR-modellen minimale directe interventie van de onderzoeker vereisen, kunnen hele cohorten muizen gemakkelijk tegelijkertijd worden getraind voor korte- of langetermijninterventiestudies. De toepassing van matige wielbelasting kan muizen er echter niet van weerhouden om grote afstanden te lopen (te weinig weerstand), of de muizen stoppen bijna volledig met rennen vanwege de methode van belastingstoepassing (te veel weerstand). Het progressive weighted-wheel-running (PoWeR) LWR-model ontwikkeld door Dungan et al. (2019)17 levert significante spieraanpassingen op, zoals vezelhypertrofie, maar bevordert ook een verschuiving naar een meer oxidatief fenotype. De beperking van PoWeR als een echt "op weerstand gebaseerd" model is dat het een stimulus met een hoger volume (afstand) en lagere belasting (weerstand) oproept, meer een weerspiegeling van een hybride trainingsregime dat een combinatie van zowel weerstands- als uithoudingsstimuli biedt. Daarom is een nieuw high-loaded wheel running (HLWR) -model ontwikkeld voor muizen dat het PoWeR-model heeft aangepast om meer een weerstandsgerichte stimulus te bieden waarbij de externe belasting wordt toegepast en geleidelijk wordt verhoogd, waardoor muizen kunnen blijven rennen, maar met veel hogere belastingen dan eerder gebruikt. Ons model gebruikte hetzelfde concept van ongebalanceerde wielbelasting als het PoWeR-model, maar met een eenvoudiger en goedkoper systeem. Naast het "normale" sporadische (aan en uit) loopwielgedrag van muizen, zorgt ongebalanceerde wielbelasting ervoor dat muizen in onderbroken "spurts" lopen. Dit komt omdat de muis de belasting tijdens de eerste helft van de omwenteling naar de bovenkant van het wiel moet trekken (tegengesteld aan de zwaartekracht), alleen om te "kusten" of "vrij wiel" als de lading tijdens de tweede helft van de omwenteling met de zwaartekracht naar beneden valt.
Na 9 weken training vertoonde de soleusspier van HLWR-muizen een toename van 21,4% in spiermassa, maar geen verschil in vezel-CSA. Terwijl de plantarisspier van HLWR-muizen geen significante toename van spiermassa vertoonde, leek het aandeel vezels met grotere CSA toe te nemen. Konhilas et al. en Soffe et al. observeerden geen verschillen in spiergroei tussen lage weerstand en hoge weerstand wiellopen19,23; in de huidige studie nam de soleusmassa echter toe met ~ 10% en ~ 20% in respectievelijk de LWR- en HLWR-groepen. Het lijkt waarschijnlijk dat spierhypertrofie als reactie op het nieuwe HLWR-weerstandstrainingsmodel spier- en vezeltypespecifiek kan zijn; nader onderzoek is echter nodig om dit idee te bevestigen. De in situ spierfunctietest werd uitgevoerd als een enkele acute sessie, alleen op de rechterpoot van de muis aan het einde van het 9 weken durende protocol, onmiddellijk vóór euthanasie en weefselverzameling. Spiermassa (natte massa genormaliseerd tot lichaamsmassa) die hier wordt gerapporteerd, is alleen afkomstig van de linkerarm van de muis, omdat er een aanzienlijke zwelling / oedeem is van de chirurgische ingreep die de natte massa in de spieren van de rechterpoot kan veranderen.
Het belang van dit nieuwe HLWR-model is dat het aantoont dat muizen zullen blijven rennen met relatief hoge belastingen op het wiel. Wielbelasting in relatie tot de gemiddelde lichaamsmassa (% BM) van C57BL/6-muizen is gebaseerd op de gemiddelde lichaamsmassa van muizen die in dit project worden gebruikt (~ 26 g). De gemiddelde lichaamsmassa van de muis varieert afhankelijk van de stam, leeftijd en geslacht. De hoogste belastingen van 10-12,5 g in het HLWR-model (gelijk aan ~ 40% -50% van de lichaamsmassa van de muis) zijn aanzienlijk hoger dan die van het PoWeR-model (maximaal = 6 g), of ongeveer twee keer de wielweerstand. Hoewel niet statistisch significant, lijkt er een sterke afname van de rijafstand te zijn naarmate de wielbelasting in week 6 en daarna van het HLWR-model voorbij 7,5 g vorderde, terwijl LWR een constante gemiddelde rijafstand handhaafde voor de rest van het 9-wekenprotocol. Het falen van hoge wielbelastingen in het HLWR-model om de rijafstand aanzienlijk te dempen, is een beperking van deze bevindingen; dit kan echter worden verzacht met grotere cohortgroottes, omdat er een zeer hoge variabiliteit was in de hardloopprestaties binnen de groepen.
Het kan moeilijk zijn om de neiging van een muis te beoordelen om consequent te rennen binnen de eerste week van het acclimatiseren aan wiellopen. Omdat sommige muizen net niet genoeg rennen om spieraanpassingen op te wekken, wordt aanbevolen een minimale drempelafsnijding te implementeren voor de voortdurende opname van een bepaalde muis in wielloopgroepen. De minimumdrempelafsluiting moet een gemiddelde loopafstand van ten minste 1 km/dag zijn tijdens de eerste week van de acclimatisatie. Als een muis in de eerste week gemiddeld niet minstens 1 km/dag loopt, is het onwaarschijnlijk dat de muis de loopafstand gedurende de rest van het 9 wekenprotocol aanzienlijk zal vergroten om een substantiële stimulans te geven voor aanpassingen. In dit geval, als een bepaalde muis niet voldoet aan de minimumdrempel van 1 km/dag na de eerste acclimatisatieweek, vergrendelt u het wiel en wijst u die muis opnieuw toe aan de sedentaire groep. Het implementeren van deze minimale drempel cut-off zal de variabiliteit in hardloopstatistieken verminderen en ervoor zorgen dat muizen een adequate trainingsprikkel krijgen gedurende het 9 weken protocol. Dit is in de geest van de drie "R's" van dieronderzoek, met name reductie. Ten tweede is het belangrijk om een ingebouwd noodplan te hebben als een muis er niet in slaagt een bepaalde afstand te lopen wanneer hoge wielbelastingen worden uitgeoefend. Om ervoor te zorgen dat muizen gedurende het hele protocol van 9 weken blijven trainen, moet de belasting worden teruggebracht tot die van de vorige week als de hardloopafstand gedurende 3 opeenvolgende dagen onder de 0,25 km / dag daalt. In dit geval, als een bepaalde muis niet gemiddeld ten minste 0,25 km loopt gedurende 3 opeenvolgende dagen na het toevoegen van de belasting, kan het nodig zijn om de wielbelasting terug te brengen naar de vorige belasting om ervoor te zorgen dat de muis de rest van het 9 weken durende protocol blijft trainen. In deze studie werd waargenomen dat de meeste muizen in staat waren om afstanden te blijven lopen > 0,25 km / dag, zelfs met de hoogste belastingen (12,5 g) in het HLWR-protocol (figuur 5A). Dit noodplan werd echter geïmplementeerd voor drie van de zeven muizen in de HLWR-groep, waarbij de belasting op een bepaald moment tijdens het trainingsprotocol van 9 weken moest worden teruggebracht tot 10 g of 7,5 g. Het zou jammer zijn om een muis met succes te laten draaien voor het grootste deel van het protocol om vervolgens uit het onderzoek te worden verwijderd omdat hij de volgende fase niet kon bereiken bij zeer hoge wielbelastingen. Door de belasting iets te verminderen om ervoor te zorgen dat het gebruik van een individueel dier wordt gemaximaliseerd zonder het welzijn in gevaar te brengen. Ten slotte is het ook belangrijk om de dagelijkse (of ten minste wekelijkse) voedselconsumptie bij te houden om ervoor te zorgen dat muizen voldoende voedsel consumeren om de verhoogde fysieke activiteit te compenseren. Dit is relatief eenvoudig wanneer muizen individueel worden gehuisvest. Verwacht een toename van de voedselinname van ~ 20% in vergelijking met sedentaire muizen31.
Het is moeilijk om deze resultaten (bijvoorbeeld hardloopafstanden) direct te vergelijken met de resultaten die oorspronkelijk zijn gepubliceerd voor het PoWeR-model. Dungan et al. rapporteerden hardloopafstanden van ~ 10-12 km per dag17, terwijl muizen in het huidige protocol die het LWR-protocol uitvoerden ~ 5-6 km per dag liepen. De grote discrepantie kan worden toegeschreven aan de mannelijke muizen die in het huidige protocol worden gebruikt, vergeleken met de vrouwelijke muizen die worden gebruikt door Dungan et al., omdat vrouwelijke muizen zijn waargenomen om ~ 20% -40% verder10,32 te lopen. Bovendien gebruikten Dungan et al. metalen wielen met een metalen staafloopoppervlak, wat kan leiden tot betere loopprestaties in vergelijking met de plastic loopwielen die in het huidige protocol worden gebruikt. Eerder is gemeld dat jonge vrouwelijke C57BL/6 muizen gemiddeld 8-10 km/dag liepen op dezelfde plastic loopwielopstelling33. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om pilottests uit te voeren voor individuele laboratoriuminstellingen om de loopprestaties van muizen te bepalen als gevolg van factoren zoals spanning, geslacht, wieltype en individuele variatie.
Het belangrijkste voordeel van het hier beschreven wielloopmodel met hoge belastingsweerstand is dat het veel kosteneffectiever is dan andere modellen die dure gespecialiseerde apparatuur vereisen. Apparatuur voor deze loopwielopstelling kost een fractie van gespecialiseerde loopwielapparatuur die verkrijgbaar is bij commerciële leveranciers. Ten slotte vervullen geladen wielloopmodellen nog een van de drie "R's" van dieronderzoek-verfijning. Omdat wiellopen een volledig vrijwillige stimulus is, zijn deze modellen niet-invasief en aanzienlijk minder stressvol voor muizen in vergelijking met andere hypertrofiemodellen, met name synergetische ablatie of andere modellen die dagen of weken van operante conditionering vereisen. Toekomstige studies zouden moeten bevestigen dat het HLWR-model een grotere hypertrofische stimulus biedt in vergelijking met de gemengde uithoudingsvermogen / weerstandsstimulus van het LWR-model. Kortom, indien correct uitgevoerd, is de potentiële toepassing van dit nieuwe, progressieve, wielloopmodel met hoge belastingsweerstand een eenvoudige maar goedkope, hoge doorvoer en lage stressbestendigheidsinterventie voor muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
We willen de Graduate Student Government Association, Office of Student Research en het Department of Health and Exercise Science aan de Appalachian State University bedanken voor het verstrekken van financiering om dit project te ondersteunen. Daarnaast willen we Monique Eckerd en Therin Williams-Frey bedanken voor het toezicht op de dagelijkse activiteiten van de dieronderzoeksfaciliteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND018-6 | Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading |
| 2.5 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND022 | Used for 2.5 g increments of wheel loading |
| 8-32 x 1" stainless steel screws | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 | |
| 8-32 Wing Nuts | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| 10 µL pipette tip box (empty) | Thermo Scientific | 2140 | We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice |
| Extreme Liquid Glue | Loctite | ||
| Laminin primary antibody | Novus Biologicals | NB300-144AF647 | primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum |
| Lithium 3 V battery | n/a | CR2032 | |
| M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| MyoVision: Automated Image Quantification Platform | Wen et al. (2017) | v1.0 | https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision |
| Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid | Orchid Scientific | Polycarbonate Rat Cage Type II | https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa |
| Sigma Sport 509 Bike Computer | Sigma Sport | Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities | |
| Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm) | Kaytee | SKU# 100079369 | https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Goldberg, A. L. Protein synthesis during work-induced growth of skeletal muscle. Journal of Cell Biology. 36 (3), 653-658 (1968).
- Baar, K., Esser, K. Phosphorylation of p70S6k correlates with increased skeletal muscle mass following resistance exercise. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 276 (1), 120-127 (1999).
- Wong, T. S., Booth, F. W. Skeletal muscle enlargement with weight-lifting exercise by rats. Journal of Applied Physiology. 65 (2), 950-954 (1988).
- Hornberger Jr, T. A., Farrar, R. P. Physiological hypertrophy of the FHL muscle following 8 weeks of progressive resistance exercise in the rat. Canadian Journal of Applied Physiology. 29 (1), 16-31 (2004).
- Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
- Tamaki, T., Uchiyama, S., Nakano, S. A weight-lifting exercise model for inducing hypertrophy in the hindlimb muscles of rats. Medicine and Science in Sports and Exercise. 24 (8), 881-886 (1992).
- De Bono, J. P., Adlam, D., Paterson, D. J., Channon, K. M. Novel quantitative phenotypes of exercise training in mouse models. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 290 (4), 926-934 (2006).
- Goh, J., Ladiges, W.
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Daves, M., Vordermark, A., Kleeberger, S. R. Genetic influence on daily wheel running activity level. Physiological Genomics. 19 (3), 270-276 (2004).
- Allen, D. L., et al. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. Journal of Applied Physiology. 90 (5), 1900-1908 (2001).
- Ishihara, A., et al. Effects of running exercise with increasing loads on tibialis anterior muscle fibres in mice. Experimental Physiology. 87 (2), 113-116 (2002).
- Kurosaka, M., et al. Effects of voluntary wheel running on satellite cells in the rat plantaris muscle. Journal of Sports Science and Medicine. 8 (1), 51-57 (2009).
- Lambert, M. I., Noakes, T. D. Spontaneous running increases VO2max and running performance in rats. Journal of Applied Physiology. 68 (1), 400-403 (1990).
- Rodnick, K. J., Reaven, G. M., Haskell, W. L., Sims, C. R., Mondon, C. E. Variations in running activity and enzymatic adaptations in voluntary running rats. Journal of Applied Physiology. 66 (3), 1250-1257 (1989).
- Sexton, W. L. Vascular adaptations in rat hindlimb skeletal muscle after voluntary running-wheel exercise. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 287-296 (1995).
- Dungan, C. M., et al. Elevated myonuclear density during skeletal muscle hypertrophy in response to training is reversed during detraining. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 316 (5), 649-654 (2019).
- Ishihara, A., Roy, R. R., Ohira, Y., Ibata, Y., Edgerton, V. R. Hypertrophy of rat plantaris muscle fibers after voluntary running with increasing loads. Journal of Applied Physiology. 84 (6), 2183-2189 (1998).
- Konhilas, J. P., et al. Loaded wheel running and muscle adaptation in the mouse. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (1), 455-465 (2005).
- Legerlotz, K., Elliott, B., Guillemin, B., Smith, H. K. Voluntary resistance running wheel activity pattern and skeletal muscle growth in rats: Wheel running activity pattern and muscle growth. Experimental Physiology. 93 (6), 754-762 (2008).
- Mobley, C. B., et al. Progressive resistance-loaded voluntary wheel running increases hypertrophy and differentially affects muscle protein synthesis, ribosome biogenesis, and proteolytic markers in rat muscle. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 102 (1), 317-329 (2018).
- D'Hulst, G., Palmer, A. S., Masschelein, E., Bar-Nur, O., De Bock, K. Voluntary resistance running as a model to induce mTOR activation in mouse skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 10, 1271 (2019).
- Soffe, Z., Radley-Crabb, H. G., McMahon, C., Grounds, M. D., Shavlakadze, T. Effects of loaded voluntary wheel exercise on performance and muscle hypertrophy in young and old male C57Bl/6J mice: Exercise and muscle hypertrophy in old mice. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports. 26 (2), 172-188 (2016).
- White, Z., et al. Voluntary resistance wheel exercise from mid-life prevents sarcopenia and increases markers of mitochondrial function and autophagy in muscles of old male and female C57BL/6J mice. Skeletal Muscle. 6 (1), 45 (2016).
- Murach, K. A., McCarthy, J. J., Peterson, C. A., Dungan, C. M. Making mice mighty: Recent advances in translational models of load-induced muscle hypertrophy. Journal of Applied Physiology. 129 (3), 516-521 (2020).
- Swallow, J. G., Garland, T., Carter, P. A., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Effects of voluntary activity and genetic selection on aerobic capacity in house mice (Mus domesticus). Journal of Applied Physiology. 84 (1), 69-76 (1998).
- Murach, K. A., et al. Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging. Aging Cell. 21 (1), 13527 (2022).
- Mackay, A. D., Marchant, E. D., Louw, M., Thomson, D. M., Hancock, C. R. Exercise, but not metformin prevents loss of muscle function due to doxorubicin in mice using an in situ method. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9163 (2021).
- Godwin, J. S., Hodgman, C. F., Needle, A. R., Zwetsloot, K. A., Andrew, R. Whole-body heat shock accelerates recovery from impact- induced skeletal muscle damage in mice. Conditioning Medicine. 2 (4), 184-191 (2020).
- Wen, Y., et al. MyoVision: Software for automated high-content analysis of skeletal muscle immunohistochemistry. Journal of Applied Physiology. 124 (1), 40-51 (2018).
- Manzanares, G., Brito-da-Silva, G., Gandra, P. G. Voluntary wheel running: Patterns and physiological effects in mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 52 (1), 7830 (2019).
- Bartling, B., et al. Sex-related differences in the wheel-running activity of mice decline with increasing age. Experimental Gerontology. 87, 139-147 (2017).
- Zwetsloot, K. A., Westerkamp, L. M., Holmes, B. F., Gavin, T. P. AMPK regulates basal skeletal muscle capillarization and VEGF expression, but is not necessary for the angiogenic response to exercise: AMPK and the skeletal muscle angiogenic response to exercise. The Journal of Physiology. 586 (24), 6021-6035 (2008).
