Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)
Summary
Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA’s in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC’s) met een hoge efficiëntie.
Abstract
Het huidige protocol beschrijft het gebruik van lentivirale deeltjes voor de levering van korte haarspeldrna’s (shRNA’s) aan zowel menselijke embryonale stamcellen (hESCs) als neurale voorlopercellen (NPC’s) afgeleid van hESCs met een hoge efficiëntie. Lentivirale deeltjes werden gegenereerd door hek293T-cellen te co-transfecteren met behulp van entryvectoren (die shRNA’s dragen) samen met verpakkingsplasmiden (pAX en pMD2.G) met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI). Virale deeltjes werden geconcentreerd met behulp van ultracentrifugatie, wat resulteerde in gemiddelde titers boven 5 x 107. Zowel hESCs als NPC’s kunnen met hoge efficiëntie worden geïnfecteerd met behulp van deze lentivirale deeltjes, zoals blijkt uit puromycineselectie en stabiele expressie in hESCs, evenals voorbijgaande GFP-expressie in NPC’s. Bovendien toonde western blot-analyse een significante vermindering van de expressie van genen gericht op shRNA’s. Bovendien behielden de cellen hun pluripotentie en differentiatiepotentieel, zoals blijkt uit hun daaropvolgende differentiatie in verschillende afstammingslijnen van het CZS. Het huidige protocol gaat over de levering van shRNA’s; dezelfde benadering kan echter worden gebruikt voor de ectopische expressie van cDA’s voor overexpressiestudies.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) afgeleid van de blastocyst binnenste celmassa zijn pluripotent en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen, afhankelijk van externe factoren onder in vitro omstandigheden 1,2. Om het potentieel van hESCs volledig te benutten, is het noodzakelijk om snelle en betrouwbare genafgiftemethoden voor deze cellen te hebben. Conventioneel kunnen de gebruikte technieken grofweg worden ingedeeld in twee typen: niet-virale en virale genafgiftesystemen 3,4. De meest gebruikte niet-virale genafgiftesystemen zijn lipofectie, elektroporatie en nucleofection. Niet-virale toedieningssystemen zijn voordelig vanwege minder insertiemutaties en een algehele afname van immunogeniciteit 5,6. Deze methoden resulteren echter in een lage transfectie-efficiëntie en een korte duur van voorbijgaande genexpressie, wat een belangrijke beperking is voor langetermijndifferentiatiestudies7. Elektroporatie resulteert in een betere transfectie-efficiëntie in vergelijking met lipofectie; het resulteert echter in meer dan 50% celdood 8,9,10. Met behulp van nucleofection kunnen de celoverleving en transfectie-efficiëntie worden verbeterd door lipofectie en elektroporatie te combineren, maar de aanpak heeft celspecifieke buffers en gespecialiseerde apparatuur nodig en wordt dus behoorlijk duur voor opgeschaalde toepassingen 11,12.
Daarentegen hebben virale vectoren verbeterde transfectie-efficiënties aangetoond, evenals een algehele lage cytotoxiciteit, na transductie. Bovendien zijn de geleverde genen stabiel tot expressie gebracht en maken deze methode dus ideaal voor langetermijnstudies13. Een van de meest gebruikte virale vectoren voor genafgifte in hESCs zijn lentivirale vectoren (LVS), die meer dan 80% transductie-efficiëntie kunnen geven met behulp van virale deeltjes met een hoge titer14,15. Lipofectie en CaPO 4-precipitatie behoren tot de meest gebruikte methoden om HEK293T-cellen of zijn derivaten tijdelijk te transfecteren met genoverdrachtsvectoren samen met verpakkingsplasmiden om lentivirale deeltjes16 te produceren. Hoewel lipofectie resulteert in een goede transfectie-efficiëntie en lage cytotoxiciteit, wordt de techniek belemmerd door de kosten, en opschalen om hoge titer lentivirale deeltjes te krijgen zou erg duur zijn. CaPO4-neerslag resulteert in relatief vergelijkbare transfectie-efficiënties als die verkregen met behulp van lipofectie. Hoewel kosteneffectief, resulteert CaPO4-neerslag in aanzienlijke celdood na transfecties, wat het moeilijk maakt om te standaardiseren en batch-to-batch variaties te vermijden17. In dit scenario is het ontwikkelen van een methode die een hoge transfectie-efficiëntie, lage cytotoxiciteit en kosteneffectiviteit geeft, cruciaal voor de productie van lentivirale deeltjes met een hoge titer die in hESCs worden gebruikt.
Polyethylenimine (PEI) is een kationisch polymeer dat HEK293T-cellen met een hoge efficiëntie kan transfecteren zonder veel cytotoxiciteit en heeft een verwaarloosbare kost in vergelijking met op lipofectie gebaseerde methoden18. In deze situatie kan PEI worden gebruikt voor opgeschaalde toepassingen van lvs-productie met een hoge titer door de concentratie van lentivirale deeltjes uit kweeksupernatanten met behulp van verschillende technieken. Het gepresenteerde artikel beschrijft het gebruik van PEI om HEK293T-cellen en lentivirale vectorconcentratie te transfecteren met behulp van ultracentrifugatie via een sucrosekussen. Met behulp van deze methode verkrijgen we regelmatig titers ruim boven 5 x 107 IE / ml met lage batch-to-batch variaties. De methode is eenvoudig, ongecompliceerd en kosteneffectief voor opgeschaalde toepassingen voor genafgifte aan hESCs en hESCs-afgeleide cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermogen om stamcellen genetisch te modificeren voor studie of klinische doeleinden wordt beperkt door zowel technologie als het basisbegrip van de biologie van hESCs. Technieken die een aanzienlijk potentieel hebben aangetoond in muis-SER’s, zoals lipofectie en elektroporatie, zijn niet erg efficiënt voor hESCs, die notoir moeilijk zijn voor genafgifte met conventionele methoden20. Dit idee heeft niet alleen geleid tot de optimalisatie van bestaande technieken, maar ook tot de ontwikkeling v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen van de United Arab Emirates University (UAEU), grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) en # 12R010 (UAEU-AUA-beurs). We bedanken Prof Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) voor het helpen bewerken van het manuscript voor stijl en grammatica.
Alle gegevens zijn op aanvraag beschikbaar.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O’Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017 (2016).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
