低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達
Summary
低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いて、H9ヒト胚性幹細胞(hESC)およびH9由来神経前駆細胞(NPC)においてshRNAを安定的に発現させるレンチウイルス粒子を高効率で製造しました。
Abstract
現在のプロトコルは、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびhESCに由来する神経前駆細胞(NPC)の両方に短いヘアピンRNA(shRNA)を高効率で送達するためのレンチウイルス粒子の使用を記載している。レンチウイルス粒子は、低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を使用してパッケージングプラスミド(pAXおよびpMD2.G)とともに、エントリーベクター(shRNAを担持)を使用してHEK293T細胞を同時トランスフェクトすることによって生成されました。ウイルス粒子を超遠心分離を用いて濃縮し、平均力価が5 x107を超える結果となった。hESCsおよびNPCsは、ピューロマイシン選択およびhESCにおける安定発現、ならびにNPCにおける一過性GFP発現によって示されるように、これらのレンチウイルス粒子を使用して高効率で感染することができる。さらに、ウェスタンブロット解析は、shRNAによって標的とされる遺伝子の発現の有意な減少を示した。さらに、細胞は、CNSの異なる系統へのその後の分化によって証明されるように、それらの多能性ならびに分化能を保持した。現在のプロトコルはshRNAの送達を扱っている。しかし、過剰発現研究のためのcDNAの異所性発現にも同じアプローチが使用できる。
Introduction
胚盤胞内部細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(hESC)は多能性であり、in vitro条件下で外的要因に応じて異なる細胞型に分化することができる1,2。hESCの可能性を最大限に引き出すためには、これらの細胞に対して迅速かつ信頼性の高い遺伝子送達方法が不可欠です。従来、使用される技術は、大きく2つのタイプに分類することができる:非ウイルスおよびウイルス遺伝子送達系3、4。より頻繁に使用される非ウイルス遺伝子送達系は、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオフェクションである。非ウイルス送達系は、挿入変異が少なく、免疫原性の全体的な低下のために有利である5,6。しかしながら、これらの方法は、低いトランスフェクション効率および短い一過性遺伝子発現の持続時間をもたらし、これは長期分化研究のための主要な制限である7。エレクトロポレーションは、リポフェクションと比較してより良いトランスフェクション効率をもたらす。しかしながら、それは50%以上の細胞死をもたらす8、9、10。ヌクレオフェクションを使用すると、リポフェクションとエレクトロポレーションを組み合わせることで細胞の生存率とトランスフェクション効率を向上させることができますが、このアプローチには細胞固有のバッファーと特殊な機器が必要であり、したがって、スケールアップされたアプリケーションにとっては非常にコストがかかります11,12。
対照的に、ウイルスベクターは、形質導入後、改善されたトランスフェクション効率、ならびに全体的な低い細胞毒性を示している。さらに、送達された遺伝子は安定に発現しているため、この方法は長期的な研究に理想的です13。hESCへの遺伝子送達に最も一般的に使用されるウイルスベクターの中には、レンチウイルスベクター(LVS)があり、これは高力価のウイルス粒子14、15を使用して80%以上の形質導入効率を与えることができる。リポフェクションおよびCaPO4 沈殿は、HEK293T細胞またはその誘導体をパッケージングプラスミドとともに遺伝子導入ベクターで一過性にトランスフェクトしてレンチウイルス粒子を作製するために最も一般的に使用される方法の1つである16。リポフェクションは良好なトランスフェクション効率と低い細胞毒性をもたらすが、この技術はそのコストによって妨げられており、高力価のレンチウイルス粒子を得るためにスケールアップすることは非常にコストがかかるであろう。CaPO4 沈殿は、リポフェクションを用いて得られたものと比較的類似したトランスフェクション効率をもたらす。費用対効果は高いものの、CaPO4 沈殿はトランスフェクション後に著しい細胞死をもたらし、標準化を困難にし、バッチ間の変動を回避することを困難にしています17。このシナリオでは、高いトランスフェクション効率、低い細胞毒性、および費用対効果を提供する方法を開発することは、hESCに使用される高力価レンチウイルス粒子の製造にとって極めて重要である。
ポリエチレンイミン(PEI)は、細胞毒性をあまり持たずに高効率でHEK293T細胞をトランスフェクトできるカチオン性ポリマーであり、リポフェクションベースの方法と比較して無視できるコストを有する18。このような状況では、PEIは、様々な技術を用いて培養上清からのレンチウイルス粒子の濃縮を通じて、高力価LVS産生のスケールアップされた用途に使用することができる。提示された論文では、PEIを使用してHEK293T細胞をトランスフェクトし、スクロースクッションを介して超遠心分離を使用してレンチウイルスベクター濃度をトランスフェクトする方法について説明します。この方法を使用して、バッチ間の変動が少ない5 x107 IU/mLをはるかに超える力価を定期的に取得します。この方法は、hESCおよびhESC由来細胞への遺伝子送達のためのスケールアップされたアプリケーションに対して、シンプルで簡単で費用対効果が高い。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究または臨床目的のために幹細胞を遺伝子改変する能力は、技術およびhESCの生物学の基本的な理解の両方によって制限される。リポフェクションやエレクトロポレーションなど、マウスESCにおいて大きな可能性を示している技術は、従来の方法では遺伝子送達が困難であることで悪名高いhESCにとって非常に効率的ではない20。この概念は、既存の技術の最適化だけでなく…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、アラブ首長国連邦大学(UAEU)からの研究助成金、助成金#31R170(ザイード健康科学センター)および#12R010(UAEU-AUA助成金)によって支援されました。ランドール・モース教授(ニューヨーク州オールバニーのワズワース・センター)が、スタイルと文法の原稿の編集を手伝ってくれたことに感謝します。
すべてのデータは要求に応じて利用可能です。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Riferimenti
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