Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.
Malaria ist mit mehr als 200 Millionen Fällen pro Jahr weltweit ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit. Trotz jahrelanger wissenschaftlicher Bemühungen ist die schützende Immunität gegen Malaria immer noch unzureichend verstanden, was vor allem auf methodische Einschränkungen der Langzeitkultur von Plasmodium, insbesondere für Plasmodium vivax, zurückzuführen ist. Die meisten Studien konzentrierten sich auf den adaptiven Immunschutz gegen Malaria durch Antikörper, die eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle von Malaria spielen. Der sterile Schutz, der durch abgeschwächte Plasmodium-Sporozoiten-Impfstoffe induziert wird, hängt jedoch mit der zellulären Reaktion zusammen, hauptsächlich mit zytotoxischen T-Lymphozyten wie CD8+ und gamma-delta-T-Zellen (γδ T). Daher müssen neue Methoden entwickelt werden, um die Funktionen der zellulären Immunantwort besser zu verstehen und so zukünftige Therapie- und Impfstoffentwicklungen zu unterstützen. Um eine neue Strategie zur Analyse dieser zellvermittelten Immunität gegen eine Infektion im Plasmodium-Blutstadium zu finden, hat unsere Gruppe einen In-vitro-Assay entwickelt, der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen (iRBC) durch zytotoxische Lymphozyten misst. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Mechanismen der zellulären Immunantwort gegen verschiedene Plasmodium spp. im Blutstadium zu untersuchen. Angeborene und adaptive zytotoxische Immunzellen können iRBCs und den intrazellulären Parasiten in einem Effektor-Ziel-Mechanismus direkt eliminieren. Ziel-iRBCs werden markiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, und mit Effektorzellen (CD8+ T, γδ T, NK-Zellen usw.) kokultiviert. Der Lyseprozentsatz wird auf der Grundlage getesteter Bedingungen berechnet, verglichen mit einer spontanen Lysekontrolle in einem durchflusszytometrischen Assay. Letztendlich ist diese Methode des Abtötungstests ein großer Fortschritt im Verständnis der zellvermittelten Immunität gegen Malaria im Blutstadium, der dazu beiträgt, neue potenzielle therapeutische Ziele zu entdecken und die Entwicklung von Malariaimpfstoffen zu beschleunigen.
Malaria ist nach wie vor eine globale Gesundheitskrise, mit mehr als 240 Millionen Fällen und 627.000 Todesfällen im Zusammenhang mit Malaria im Jahr 20201. Derzeit gibt es fünf parasitäre Arten, die beim Menschen Malaria verursachen können, von denen Plasmodium falciparum und Plasmodium vivax die beiden am weitesten verbreiteten Arten sind. Während einer Plasmodium-Infektion ist die Leber oder das präerythrozytäre Stadium asymptomatisch, und die Symptome treten nur während des asexuellen Zyklus des Parasiten im erythrozytären Stadium auf. In diesem Infektionsstadium werden Tausende von Merozoiten aus dem Leberstadium in den Blutkreislauf freigesetzt und infizieren rote Blutkörperchen (RBCs). Bei den Erythrozyten differenzieren sich die Parasiten durch Schizogonie in Trophozoiten und Schizonten, bis Schizonten die Erythrozyten aufbrechen und neu gebildete Merozoiten freisetzen, wodurch sich dieser Blutzyklus wiederholt. Wiederholte Zyklen von Invasion, Replikation und Merozoitenfreisetzung führen zu einem exponentiellen Wachstum der Parasitenpopulation und lösen schließlich Krankheitssymptomeaus 2.
Eine wichtige Herausforderung bei der Untersuchung der Immunantwort auf Malaria besteht darin, dass die Plasmodium spp. die den Menschen infiziert, infiziert keine Versuchstiermodelle. Daher müssen Plasmodium-infizierte Patientenproben frisch entnommen und sofort verarbeitet und analysiert werden. In Malaria-endemischen Gebieten sind die Ressourcen für den Zugang zu immunologischen und molekularen Mechanismen jedoch begrenzt. Aufgrund dieser Einschränkungen werden Nagetiere häufig als experimentelle Modelle verwendet, um die Immunantwort gegen eine Plasmodium-Infektion zu untersuchen. Während P. berghei und P. chabaudi häufig als Surrogate für eine P. falciparum-Infektion verwendet werden, weist der nicht-letale Stamm von P. yoelii 17XNL auch viele Gemeinsamkeiten mit P. vivax auf, wie z. B. eine retikulozyten-restriktive Infektion 3,4. Die Entwicklung von Plasmodium-In-vitro-Assays, die für Proben aus menschlichen oder tierischen Modellen verwendet werden können, ist wertvoll, um die Pathogenese von Malaria besser zu verstehen und die immunologische Reaktion verschiedener Parasitenarten zu vergleichen.
Die schützende Immunität gegen Malaria ist weder im präerythrozytären noch im Blutstadium vollständig verstanden. Es ist bekannt, dass die Exposition gegenüber wiederholten Infektionen zu einer teilweise erworbenen Immunität führt, aber eine sterile Immunität wird selten entwickelt5. Jahrzehntelang war die Anti-Plasmodium-protektive Immunität hauptsächlich mit der Induktion von neutralisierenden oder opsonisierenden Antikörpern verbunden, die das Eindringen von Parasiten in Wirtszellen verhindernbzw. zu einer Phagozytose durch antigenpräsentierende Zellen führen 6. Infolgedessen beruhten die meisten Bemühungen zur Herstellung von Malariaimpfstoffen bisher auf der Induktion schützender und lang anhaltender Antikörper 7,8. Der sterile Schutz, der durch die Impfung mit einem abgeschwächten Sporozoiten induziert wird, korreliert jedoch direkt mit der Aktivierung und Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten 8,9.
In jüngster Zeit haben einige Studien an frisch isolierten Patientenproben und In-vitro-Kulturen gezeigt, dass angeborene oder adaptive zytotoxische Immunzellen wie CD8+ T10, γδ T 11 und NK-Zellen12 Plasmodium-infizierte Erythrozyten und ihren intrazellulären Parasiten direkt in einem Effektor-Ziel-Verhältnis eliminieren können. Diese bahnbrechenden Erkenntnisse definierten einen völlig neuen Immuneffektor-Mechanismus im Zusammenhang mit Malaria. Um diese neuartige Antimalaria-Immunität zu entschlüsseln, ist es wichtig, zytotoxische Effektormechanismen von Killerzellen gegen infizierte Erythrozyten (iRBCs) bei einer natürlichen Infektion oder Impfung zu untersuchen.
Hier stellen wir einen in vitro Assay vor, der die zytotoxische Aktivität von Lymphozyten gegen Malaria im Blutstadium misst. Dieser Assay kann dann helfen, die Mechanismen der zellulären Immunantwort gegen das Plasmodium-Erythrozytenstadium aufzuklären. Die Zielzellen, iRBCs, werden mit Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) markiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, und dann mit Effektorzellen wie zytotoxischen Lymphozyten (CTL) kokultiviert. Diese Kokultur wird dann durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern für bestimmte Zelltypen bewertet. Schließlich wird der Prozentsatz der iRBC-Lyse durch CTL berechnet, indem die experimentelle Bedingung durch den spontanen Bruch der Erythrozyten und die spontane Lysekontrolle dividiert wird, die während der Inkubation ohne die Effektorzelle auftritt. Insgesamt kann diese Methode des Abtötungstests zu einem besseren Verständnis der zellvermittelten Malariaimmunität beitragen.
Hier beschreiben wir einen in vitro Assay zur Messung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten. Dieser Assay kann dazu beitragen, die Mechanismen der zellulären schützenden Immunität gegen das erythrozytäre Stadium des Malariaparasiten aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Methodik besteht darin, dass sie einen quantitativen Assay der zellvermittelten Abtötung von iRBCs liefert, der verwendet werden kann, um viele Fragen darüber zu beantworten, …
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Dhelio Pereira und den Mitgliedern des Forschungszentrums für Tropenmedizin von Rondônia (CEPEM) für die Aufnahme von Malariapatienten und die Blutentnahme sowie Felicia Ho für die Hilfe bei der Überarbeitung des Manuskripts. Das folgende Reagenz wurde von BEI Resources, NIAID, NIH erhalten: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Stamm 17XNL:PyGFP, MRA-817, beigesteuert von Ana Rodriguez. Diese Forschung wurde unterstützt durch den Lemann Brazil Research Fund, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – 437851/2018-4, Stipendien (CJ, GC, CG) und Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) – APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Stipendium (LL).
100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |