In vitro Saggio dell'uccisione dei globuli rossi infetti da plasmodio da parte di linfociti citotossici

Summary

Qui descriviamo un nuovo metodo per aiutare a chiarire i meccanismi dell’immunità cellulare al Plasmodium durante la fase ematica dell’infezione. Questo è un test in vitro che misura l’uccisione dei globuli rossi infetti da parte dei linfociti citotossici.

Abstract

La malaria è una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica, presentando oltre 200 milioni di casi all’anno in tutto il mondo. Nonostante anni di sforzi scientifici, l’immunità protettiva alla malaria è ancora poco conosciuta, principalmente a causa dei limiti metodologici della coltura di Plasmodium a lungo termine, in particolare per il Plasmodium vivax. La maggior parte degli studi si è concentrata sulla protezione dell’immunità adattativa contro la malaria da parte degli anticorpi, che svolgono un ruolo chiave nel controllo della malaria. Tuttavia, la protezione sterile indotta dai vaccini attenuati contro gli sporozoiti del Plasmodium è correlata alla risposta cellulare, principalmente ai linfociti T citotossici, come le cellule T CD8⁺ e gamma delta (γδ T). Pertanto, devono essere sviluppate nuove metodologie per comprendere meglio le funzioni della risposta immunitaria cellulare e quindi supportare la terapia futura e lo sviluppo di vaccini. Per trovare una nuova strategia per analizzare questa immunità cellulo-mediata all’infezione da stadio ematico del Plasmodium, il nostro gruppo ha stabilito un test in vitro che misura l’uccisione dei globuli rossi infetti (iRBC) da parte dei linfociti citotossici. Questo test può essere utilizzato per studiare i meccanismi di risposta immunitaria cellulare contro diversi Plasmodium spp. nella fase del sangue. Le cellule immunitarie citotossiche innate e adattative possono eliminare direttamente gli iRBC e il parassita intracellulare in un meccanismo effettore:bersaglio. Gli iRBC bersaglio sono marcati per valutare la vitalità cellulare e cocoltati con cellule effettrici (cellule CD8⁺ T, γδ T, cellule NK, ecc.). La percentuale di lisi viene calcolata in base alle condizioni testate, rispetto a un controllo spontaneo della lisi in un test basato sulla citometria a flusso. In definitiva, questa metodologia di analisi dell’uccisione è un importante progresso nella comprensione dell’immunità cellulo-mediata alla malaria in fase ematica, aiutando a scoprire nuovi potenziali bersagli terapeutici e accelerare lo sviluppo di vaccini contro la malaria.

Introduction

La malaria rimane una crisi sanitaria globale, con oltre 240 milioni di casi e 627.000 decessi correlati alla malaria segnalati nel 2020¹. Attualmente ci sono cinque specie parassitarie che possono causare la malaria negli esseri umani, tra cui Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax sono le due specie più diffuse. Durante l’infezione da Plasmodium , il fegato o lo stadio pre-eritrocitico è asintomatico e i sintomi si verificano solo durante il ciclo asessuato del parassita nella fase eritrocitica. In questa fase dell’infezione, migliaia di merozoiti derivati dallo stadio epatico vengono rilasciati nel flusso sanguigno e infettano i globuli rossi (RBC). Nei globuli rossi, i parassiti si differenziano in trofozoiti e schizonti per schizogonia, fino a quando gli schizonti rompono l’eritrocita, rilasciando merozoiti appena formati, ripetendo questo ciclo sanguigno. Cicli ripetuti di invasione, replicazione e rilascio di merozoiti provocano una crescita esponenziale della popolazione di parassiti e alla fine innescano i sintomi della malattia².

Una sfida importante nello studio della risposta immunitaria alla malaria è che il Plasmodium spp. che infetta gli esseri umani non infetta i modelli animali da laboratorio. Pertanto, i campioni di pazienti infetti da plasmodio devono essere raccolti freschi e immediatamente elaborati e analizzati. Tuttavia, nelle aree endemiche della malaria, le risorse per accedere ai meccanismi immunologici e molecolari sono limitate. A causa di queste limitazioni, i roditori sono ampiamente utilizzati come modelli sperimentali per studiare la risposta immunitaria contro l’infezione da Plasmodium. Mentre P. berghei e P. chabaudi sono spesso usati come surrogati per l’infezione da P. falciparum, il ceppo non letale di P. yoelii 17XNL ha anche molte caratteristiche in comune con P. vivax, come l’infezione limitata ai reticolociti ^3,4. Lo sviluppo di saggi in vitro di Plasmodium, che possono essere utilizzati per campioni derivati da modelli umani o animali, è prezioso per ottenere una migliore comprensione della patogenesi della malaria e confrontare la risposta immunologica suscitata da diverse specie del parassita.

L’immunità antimalarica protettiva non è completamente compresa né allo stadio pre-eritrocitico né allo stadio sanguigno. È noto che l’esposizione a infezioni ripetute provoca un’immunità acquisita parziale, ma l’immunità sterile è raramente sviluppata⁵. Per decenni, l’immunità protettiva anti-Plasmodium è stata principalmente associata all’induzione di anticorpi neutralizzanti o opsonizzanti che impediscono l’invasione parassitaria delle cellule ospiti o portano alla fagocitosi da parte delle cellule presentanti l’antigene, rispettivamente⁶. Di conseguenza, la maggior parte degli sforzi per produrre vaccini antimalarici finora si sono basati sull’induzione di anticorpi protettivi e di lunga durata ^7,8. Tuttavia, la protezione sterile indotta dalla vaccinazione con uno sporozoite attenuato è direttamente correlata con l’attivazione e l’espansione dei linfociti T citotossici ^8,9.

Recentemente, alcuni studi su campioni di pazienti appena isolati e colture in vitro hanno dimostrato che le cellule immunitarie citotossiche innate o adattative come CD8 ⁺ T 10, γδ T¹¹ e cellule NK¹² possono eliminare direttamente i globuli rossi infetti da plasmodio e il suo parassita intracellulare in modo effettore:rapporto bersaglio. Questi risultati seminali hanno definito un meccanismo effettore immunitario completamente nuovo nel contesto della malaria. Per analizzare questa nuova immunità antimalarica, è essenziale esplorare i meccanismi effettori citotossici delle cellule killer contro i globuli rossi infetti (iRBC) nell’infezione naturale o nella vaccinazione.

Qui presentiamo un test in vitro che misura l’attività citotossica dei linfociti contro la malaria nella fase del sangue. Questo test può quindi aiutare a chiarire i meccanismi della risposta immunitaria cellulare contro lo stadio eritrocitario del Plasmodium . Le cellule bersaglio, iRBC, sono marcate con carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) per valutare la vitalità cellulare e sono quindi cocoltivate con cellule effettrici come i linfociti citotossici (CTL). Questa cocoltura viene quindi valutata mediante citometria a flusso, utilizzando marcatori fluorescenti per specifici tipi di cellule. Infine, la percentuale di lisi di iRBC da CTL viene calcolata dividendo la condizione sperimentale per la rottura spontanea dei globuli rossi e il controllo spontaneo della lisi, che si verifica durante l’incubazione senza la cellula effettrice. Nel complesso, questa metodologia di analisi dell’uccisione può contribuire a una migliore comprensione dell’immunità alla malaria cellulo-mediata.

Protocol

Tutte le procedure sono state condotte seguendo le politiche della Fondazione Oswaldo Cruz e del Consiglio Etico Nazionale (CAAE: 59902816.7.0000.5091). I protocolli umani sono stati sviluppati in collaborazione con il gruppo di ricerca clinica del Centro di ricerca per la medicina tropicale di Rondônia (CEPEM), che era incaricato di arruolare i pazienti nello studio. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti. Per lo studio sugli animali, le procedure sono state eseguite seg…

Representative Results

Qui viene descritta la metodologia applicata per l’isolamento di globuli rossi infetti da plasmodio marcati con CFSE in un test di cocoltura con linfociti citotossici. In primo luogo, forniamo una rappresentazione schematica di come eseguire il protocollo, impiegando campioni umani infetti da P. vivax (Figura 1). Quindi, un diagramma di flusso illustrato su come procedere con il protocollo in un modello sperimentale di malaria utilizzando un topo C57BL / 6 infetto da P….

Discussion

Qui descriviamo un test in vitro per misurare l’uccisione dei globuli rossi infetti da plasmodio da parte dei linfociti citotossici. Questo test può aiutare a chiarire i meccanismi dell’immunità protettiva cellulare allo stadio eritrocitico del parassita della malaria. Il principale vantaggio di questa metodologia è che fornisce un test quantitativo dell’uccisione cellulo-mediata degli iRBC che può essere utilizzato per affrontare molte domande su come le cellule immunitarie interagiscono con divers…

Materials

100 μM cell strainer	Corning	431752
96 Well Round (U) Bottom Plate	Thermo Scientific	12-565-65
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody	Biolegend	349114	Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100
Anti-human CD3 Antibody	Biolegend	317314	Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200
Anti-human CD8 Antibody	Biolegend	344714	Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200
Anti-human TCR Vδ2 Antibody	Biolegend	331408	Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200
Anti-mouse CD8a Antibody	Biolegend	100733	Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody	Biolegend	116223	Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34554
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	26140079
Ficoll-Paque Plus	Cytiva	17144003	Lymphocyte Separation Medium (LSM)
Heparin Sodium Injection, USP	meithel pharma	71228-400-003	Used – 2000 USP units/2mL
Isoflurane	Piramal critical care	66794-0013-25
LS MACS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Bioscience
Percoll	Cytiva	17089101	Density Gradient Separation Medium (DGSM)
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Sodium bicarbonate, powder,  BioReagent	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge;	BD	14-829-10F
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml	BD	366480