В пробирке Анализ уничтожения эритроцитов, инфицированных плазмодием, цитотоксическими лимфоцитами
Summary
Здесь мы описываем новый метод, помогающий выяснить механизмы клеточного иммунитета к плазмодию на стадии инфекции в крови. Это анализ in vitro , который измеряет уничтожение инфицированных эритроцитов цитотоксическими лимфоцитами.
Abstract
Малярия является одной из основных проблем общественного здравоохранения, ежегодно регистрируя более 200 миллионов случаев заболевания во всем мире. Несмотря на многолетние научные усилия, защитный иммунитет к малярии до сих пор плохо изучен, в основном из-за методологических ограничений долгосрочного культивирования Plasmodium, особенно для Plasmodium vivax. Большинство исследований было сосредоточено на адаптивной иммунной защите от малярии с помощью антител, которые играют ключевую роль в борьбе с малярией. Однако стерильная защита, индуцированная аттенуированными вакцинами Plasmodium sporozoits, связана с клеточным ответом, главным образом на цитотоксические Т-лимфоциты, такие как CD8+ и гамма-дельта-Т-клетки (γδ T). Следовательно, необходимо разработать новые методологии, чтобы лучше понять функции клеточного иммунного ответа и, таким образом, поддержать будущую терапию и разработку вакцин. Чтобы найти новую стратегию анализа этого клеточно-опосредованного иммунитета к инфекции Plasmodium на стадии крови, наша группа создала анализ in vitro, который измеряет уничтожение инфицированных эритроцитов (iRBC) цитотоксическими лимфоцитами. Этот анализ может быть использован для изучения механизмов клеточного иммунного ответа против различных видов Plasmodium spp. в стадии крови. Врожденные и адаптивные цитотоксические иммунные клетки могут непосредственно уничтожать iRBC и внутриклеточного паразита по механизму эффектор: мишень. Целевые эритроциты помечаются для оценки жизнеспособности клеток и культивируются совместно с эффекторными клетками (CD8+ T, γδ T, NK-клетками и т. д.). Процент лизиса рассчитывается на основе тестируемых условий по сравнению с контролем спонтанного лизиса в анализе на основе проточной цитометрии. В конечном счете, эта методология анализа убийства является важным шагом вперед в понимании клеточного иммунитета к малярии на стадии крови, помогая выявить новые потенциальные терапевтические цели и ускорить разработку вакцин против малярии.
Introduction
Малярия остается глобальным кризисом в области здравоохранения: в 2020 г. было зарегистрировано более 240 миллионов случаев заболевания малярией и 627 000 случаев смерти, связанных с малярией1. В настоящее время существует пять паразитических видов, которые могут вызывать малярию у людей, из которых Plasmodium falciparum и Plasmodium vivax являются двумя наиболее распространенными видами. Во время инфекции Plasmodium печень или преэритроцитарная стадия протекает бессимптомно, и симптомы возникают только во время бесполого цикла паразита на эритроцитарной стадии. На этой стадии инфекции тысячи мерозоитов, полученных из печени, высвобождаются в кровоток и заражают эритроциты (эритроциты). В эритроцитах паразиты дифференцируются на трофозоиты и шизонты путем шизогонии, пока шизонты не разорвут эритроцит, высвобождая новообразованные мерозоиты, повторяя этот круговорот крови. Повторяющиеся циклы инвазии, репликации и высвобождения мерозоита приводят к экспоненциальному росту популяции паразитов и, в конечном итоге, вызывают симптомы заболевания2.
Важной проблемой в изучении иммунного ответа на малярию является то, что Plasmodium spp. То, что заражает людей, не заражает модели лабораторных животных. Таким образом, образцы пациентов, инфицированных плазмодием, должны быть собраны свежими и немедленно обработаны и проанализированы. Однако в эндемичных по малярии районах ресурсы для доступа к иммунологическим и молекулярным механизмам ограничены. Из-за этих ограничений грызуны широко используются в качестве экспериментальных моделей для исследования иммунного ответа против инфекции Plasmodium. В то время как P. berghei и P. chabaudi часто используются в качестве суррогатов инфекции P. falciparum, нелетальный штамм P. yoelii 17XNL также имеет много общих черт с P. vivax, таких как инфекция с ограничением ретикулоцитов 3,4. Разработка анализов Plasmodium in vitro, которые могут быть использованы для образцов, полученных на моделях человека или животных, ценна для лучшего понимания патогенеза малярии и сравнения иммунологического ответа, вызванного различными видами паразита.
Защитный противомалярийный иммунитет до конца не изучен ни на предэритроцитарной стадии, ни на стадии крови. Известно, что воздействие повторных инфекций приводит к частичному приобретению иммунитета, но стерильный иммунитет вырабатываетсяредко5. В течение десятилетий антиплазмодиев протективный иммунитет был в основном связан с индукцией нейтрализующих или опсонизирующих антител, которые предотвращают вторжение паразитов в клетки-хозяева или приводят к фагоцитозу антигенпрезентирующими клетками, соответственно6. В результате большинство усилий по производству противомалярийных вакцин до сих пор основывалось на индуцировании защитных и длительных антител 7,8. Однако стерильная защита, индуцированная вакцинацией аттенуированным спорозоитом, напрямую коррелирует с активацией и экспансией цитотоксических Т-лимфоцитов 8,9.
Недавно некоторые исследования свежевыделенных образцов пациентов и культур in vitro показали, что врожденные или адаптивные цитотоксические иммунные клетки, такие как CD8 + T10, γδ T 11 и NK-клетки12, могут напрямую уничтожать инфицированные плазмодием эритроциты и его внутриклеточного паразита в соотношении эффектор: цель. Эти основополагающие результаты определили совершенно новый иммунный эффекторный механизм в контексте малярии. Чтобы проанализировать этот новый противомалярийный иммунитет, важно изучить цитотоксические эффекторные механизмы клеток-киллеров против инфицированных эритроцитов (iRBC) при естественной инфекции или вакцинации.
Здесь мы представляем анализ in vitro , который измеряет цитотоксическую активность лимфоцитов против малярии на стадии крови. Этот анализ может помочь выяснить механизмы клеточного иммунного ответа против стадии эритроцитов Plasmodium . Клетки-мишени, iRBCs, помечаются сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) для оценки жизнеспособности клеток, а затем культивируются совместно с эффекторными клетками, такими как цитотоксические лимфоциты (CTL). Затем эта кокультура оценивается с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентных маркеров для определенных типов клеток. Наконец, процент лизиса iRBC с помощью CTL рассчитывается путем деления экспериментального условия на спонтанный разрыв эритроцитов и контроль спонтанного лизиса, который происходит во время инкубации без эффекторной клетки. В целом, эта методология анализа убийства может способствовать лучшему пониманию клеточно-опосредованного иммунитета к малярии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем анализ in vitro для измерения уничтожения эритроцитов, инфицированных плазмодием, цитотоксическими лимфоцитами. Этот анализ может помочь выяснить механизмы клеточного защитного иммунитета к эритроцитарной стадии малярийного паразита. Основным преимущество…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Делио Перейру и сотрудников Исследовательского центра тропической медицины Рондонии (CEPEM) за регистрацию пациентов с малярией и сбор крови, а также Фелицию Хо за помощь в редактировании рукописи. Следующий реагент был получен через BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, штамм 17XNL: PyGFP, MRA-817, предоставленный Аной Родригес. Это исследование было поддержано Бразильским исследовательским фондом Lemann, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – 437851/2018-4, стипендиями (CJ, GC, CG) и Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) – APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – стипендия (LL).
Materials
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
Riferimenti
- WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
- Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
- Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
- Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
- Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
- Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
- Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
- Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
- Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
- Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
- Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
- Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
- Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
- Migliaccio, A. R. Erythroblast enucleation. Haematologica. 95 (12), 1985 (2010).
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
- Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).
