Il tratto gastrointestinale è uno degli organi più sensibili alle lesioni sui trattamenti radioterapeutici contro il cancro. È allo stesso tempo un sistema di organi con una delle più alte capacità rigenerative a seguito di tali insulti. Il protocollo presentato descrive un metodo efficace per studiare la capacità rigenerativa dell’epitelio intestinale.
L’epitelio intestinale è costituito da un singolo strato di cellule ma contiene più tipi di cellule terminalmente differenziate, che sono generate dalla proliferazione attiva delle cellule staminali intestinali situate sul fondo delle cripte intestinali. Tuttavia, durante gli eventi di danno intestinale acuto, queste cellule staminali intestinali attive subiscono la morte cellulare. L’irradiazione gamma è un trattamento del cancro del colon-retto ampiamente utilizzato che, sebbene terapeuticamente efficace, ha l’effetto collaterale di esaurire il pool di cellule staminali attive. Infatti, i pazienti sperimentano frequentemente la sindrome da radiazioni gastrointestinali durante la radioterapia, in parte a causa della deplezione di cellule staminali attive. La perdita di cellule staminali intestinali attive nelle cripte intestinali attiva un pool di cellule staminali intestinali di riserva tipicamente quiescenti e induce la dedifferenziazione delle cellule precursori secretorie ed enterocitarie. Se non fosse per queste cellule, l’epitelio intestinale mancherebbe della capacità di recuperare dalla radioterapia e da altri importanti insulti tissutali. I nuovi progressi nelle tecnologie di tracciamento del lignaggio consentono il monitoraggio dell’attivazione, della differenziazione e della migrazione delle cellule durante la rigenerazione e sono stati impiegati con successo per studiarlo nell’intestino. Questo studio mira a rappresentare un metodo per l’analisi delle cellule all’interno dell’epitelio intestinale del topo dopo lesioni da radiazioni.
L’epitelio intestinale umano coprirebbe approssimativamente la superficie di mezzo campo da badminton se posizionato completamente piatto1. Invece, questo singolo strato cellulare che separa gli esseri umani dal contenuto delle loro viscere è compattato in una serie di proiezioni simili a dita, villi e rientranze, cripte che massimizzano la superficie dell’intestino. Le cellule dell’epitelio si differenziano lungo un asse crypt-villus. I villi sono costituiti principalmente da enterociti che assorbono i nutrienti, cellule caliciformi che secernono muco e cellule enteroendocrine che producono ormoni, mentre le cripte consistono principalmente di cellule di Paneth produttrici di defensina, cellule staminali attive e di riserva e cellule progenitrici 2,3,4,5. Inoltre, la comunicazione bidirezionale che queste cellule hanno con le cellule stromali e immunitarie del compartimento mesenchimale sottostante e il microbiota del lume generano una complessa rete di interazioni che mantiene l’omeostasi intestinale ed è fondamentale per il recupero dopo l’infortunio 6,7,8.
L’epitelio intestinale è il tessuto auto-rinnovante più rapidamente nel corpo umano, con un tasso di turnover di 2-6 giorni 9,10,11. Durante l’omeostasi, le cellule staminali attive alla base delle cripte intestinali (cellule colonnari della base della cripta), contrassegnate dall’espressione del recettore 5 accoppiato alla proteina G contenente ripetizioni ricco di leucina (LGR5), si dividono rapidamente e forniscono cellule progenitrici che si differenziano in tutte le altre linee epiteliali intestinali. Tuttavia, a causa del loro alto tasso mitotico, le cellule staminali attive e i loro progenitori immediati sono particolarmente sensibili alle lesioni da radiazioni gamma e subiscono apoptosi dopo irradiazione 5,12,13,14. Alla loro perdita, le cellule staminali di riserva e le cellule non staminali (sottopopolazioni di progenitori e alcune cellule terminalmente differenziate) all’interno delle cripte intestinali subiscono l’attivazione e ricostituiscono il compartimento della cripta basale, che può quindi ricostituire le popolazioni cellulari dei villi e, quindi, rigenerare l’epitelio intestinale15. Utilizzando tecniche di tracciamento del lignaggio, diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato che le cellule staminali di riserva (quiescenti) sono in grado di supportare la rigenerazione dopo la perdita di cellule staminali attive 13,16,17,18,19,20,21,22. Queste cellule sono caratterizzate dalla presenza dell’oncogene della proteina 1 del complesso polycomb (Bmi1), del gene della trascrittasi inversa della telomerasi di topo (mTert), dell’omeobox Hop (Hopx) e del gene della proteina 1 di ripetizione ricco di leucina (Lrig1). Inoltre, è stato dimostrato che le cellule non staminali sono in grado di ricostituire le cripte intestinali in caso di lesioni 23,24,25,26,27,28,29,30,31. In particolare, è stato dimostrato che i progenitori delle cellule secretorie e degli enterociti subiscono una dedifferenziazione in caso di lesione, ritornano a cellule staminali e supportano la rigenerazione dell’epitelio intestinale. Studi recenti hanno identificato cellule che esprimono marcatori multipli che possiedono la capacità di acquisire caratteristiche simili a staminali in caso di lesione (come DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. hanno dimostrato che anche le cellule di Paneth mature (LYZ +) possono contribuire alla rigenerazione intestinale37. Inoltre, oltre a causare l’apoptosi delle cellule epiteliali intestinali e ad interrompere la funzione della barriera epiteliale, l’irradiazione provoca disbiosi della flora intestinale, attivazione delle cellule immunitarie e inizio di una risposta pro-infiammatoria e attivazione delle cellule mesenchimali e stromali38,39.
La radiazione gamma è un prezioso strumento terapeutico nel trattamento del cancro, soprattutto per i tumori del colon-retto40. Tuttavia, l’irradiazione influisce significativamente sull’omeostasi intestinale inducendo danni alle cellule, che portano all’apoptosi. L’esposizione alle radiazioni provoca molteplici perturbazioni che rallentano il recupero di un paziente ed è caratterizzata da lesioni e infiammazioni della mucosa nella fase acuta e diarrea, incontinenza, sanguinamento e dolore addominale a lungo termine. Questa panoplia di manifestazioni è indicata come tossicità da radiazioni gastrointestinali. Inoltre, la progressione indotta dalle radiazioni della fibrosi transmurale e/o della sclerosi vascolare può manifestarsi solo anni dopo il trattamento38,41. Contemporaneamente alla lesione stessa, la radiazione induce una risposta di riparazione nelle cellule intestinali che attiva le vie di segnalazione responsabili dell’avvio e dell’orchestrazione della rigenerazione42. La malattia dell’intestino tenue indotta da radiazioni può originarsi dalla radioterapia pelvica o addominale fornita ad altri organi (come cervice, prostata, pancreas, retto)41,43,44,45,46. Il danno da irradiazione intestinale è, quindi, un problema clinico significativo e una migliore comprensione della fisiopatologia risultante è probabile che faccia avanzare lo sviluppo di interventi per alleviare le complicanze gastrointestinali associate alla radioterapia. Esistono altre tecniche che consentono di indagare lo scopo rigenerativo dell’epitelio intestinale oltre alle radiazioni. Sono stati sviluppati modelli murini transgenici e chimici per studiare l’infiammazione e la successiva rigenerazione47. Il destrano solfato di sodio (DSS) induce infiammazione nell’intestino e porta allo sviluppo di caratteristiche simili a quelle della malattia infiammatoria intestinale48. Una combinazione di trattamento DSS con il composto pro-cancerogeno azoxymethane (AOM) può provocare lo sviluppo di cancro associato alla colite48,49. La lesione indotta da ischemia da riperfusione è un altro metodo impiegato per studiare il potenziale rigenerativo dell’epitelio intestinale. Questa tecnica richiede esperienza e conoscenza chirurgica50. Inoltre, le suddette tecniche causano diversi tipi di lesioni rispetto alle radiazioni e possono portare al coinvolgimento di diversi meccanismi di rigenerazione. Inoltre, questi modelli richiedono molto tempo, mentre la tecnica di radiazione è abbastanza breve. Recentemente, metodi in vitro che utilizzano enteroidi e colonoidi generati dall’intestino e dal colon sono stati utilizzati in combinazione con lesioni da radiazioni per studiare i meccanismi di rigenerazione intestinale51,52. Tuttavia, queste tecniche non ricapitolano completamente l’organo che modellano53,54.
Il protocollo presentato include la descrizione di un modello murino di danno da radiazioni gamma in combinazione con un modello genetico che, a seguito del trattamento con tamoxifene, consente di tracciare linee originate dalla popolazione di cellule staminali di riserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Questo modello utilizza un’irradiazione totale corporea di 12 Gy, che induce lesioni intestinali abbastanza significative da attivare le cellule staminali di riserva, consentendo comunque la successiva indagine della capacità rigenerativa intestinale entro 7 giorni dalla lesione55.
Questo protocollo descrive un modello di danno da radiazioni robusto e riproducibile. Consente l’analisi precisa dei cambiamenti nell’epitelio intestinale nel corso di 7 giorni dopo l’infortunio. È importante sottolineare che i punti temporali selezionati riflettono fasi cruciali della lesione e sono caratterizzati da distinte alterazioni dell’intestino (lesioni, apoptosi, rigenerazione e fasi di normalizzazione)60. Questo modello di irradiazione è stato stabilito e attentamente valutato, dimost…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano riconoscere lo Stony Brook Cancer Center Histology Research Core per l’assistenza di esperti nella preparazione dei campioni di tessuto e la Divisione delle risorse animali da laboratorio presso la Stony Brook University per l’assistenza nella cura e nella gestione degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health DK124342 assegnate ad Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.
1 mL syringe | BD | 309659 | – |
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight | VWR | 20068-630 | – |
27G x 1/2" needle | BD | 305109 | – |
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe | Covidien | 1188128012 | – |
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) | Santa Cruz Biotechnology | sc284628A | 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C |
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | – |
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson Laboratory | Strain #:006148 | |
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J | The Jackson Laboratory | Strain #:010531 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
Chicken anti-GFP | Aves | GFP-1020 | |
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638 | – |
Corn oil | Millipore-Sigma | C8267 | – |
Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | – |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | light sensitive |
DNase-free proteinase K | Invitrogen | C10618H | diluted 25x in DPBS |
Donkey anti-chicken AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
DPBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | – |
Eosin | Fisher Scientific | S176 | |
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X | Nikon | ||
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
Gamma Cell 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | – | 0.759 Gy min-1 |
Goat anti-rabbit AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668 | |
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) | Thermo Fisher Scientific | H3569 | dilution 1:1000 |
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-603-252 | – |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | L119-500 | 0.5g/1L dH2O |
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL | VWR | 89215-218 | – |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | – |
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade | Capitol Scientific | AAP-281000ACSCSLT | – |
Rabbit anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
Sodium Citrate Dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
Stainless Steel Dissecting Kit | VWR | 25640-002 | |
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
Tamoxifen | Millipore-Sigma | T5648 | 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive |
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle | Sakura | 4465 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades | Sakura | 4689 | |
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set | Sakura | 4451 | |
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid | Sakura | 4456 | |
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid | Sakura | 4457 | |
Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
Unisette Processing Cassettes | VWR | 87002-292 | – |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-081 | |
Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL |