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Biologia

이온화 조사에 대한 반응으로 장 상피 재생

Published: July 27, 2022
doi:
10.3791/64028
, , , ,
1Department of Medicine,Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics,Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

위장관은 방사선 치료 암 치료 시 손상에 가장 민감한 기관 중 하나입니다. 그것은 동시에 그러한 모욕에 이어 가장 높은 재생 능력 중 하나를 가진 장기 시스템입니다. 제시된 프로토콜은 장 상피의 재생 능력을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.

Abstract

장 상피는 단일 층의 세포로 구성되어 있지만 장 선와(intestinal crypt)의 바닥에 위치한 장 줄기 세포의 활성 증식에 의해 생성되는 여러 유형의 말기 분화 세포를 포함합니다. 그러나 급성 장 손상이 발생하는 동안 이러한 활성 장 줄기 세포는 세포 사멸을 겪습니다. 감마선 조사는 널리 사용되는 대장암 치료제로, 치료적으로는 효과적이지만 활성 줄기 세포 풀을 고갈시키는 부작용이 있습니다. 실제로 환자들은 방사선 치료를 받는 동안 부분적으로 활성 줄기 세포 고갈로 인해 위장 방사선 증후군을 자주 경험합니다. 장 선와에서 활성 장 줄기 세포의 손실은 일반적으로 정지 상태의 예비 장 줄기 세포 풀을 활성화하고 분비 및 장 세포 전구체 세포의 탈분화를 유도합니다. 이러한 세포가 아니라면 장 상피는 방사선 요법 및 기타 주요 조직 손상으로부터 회복하는 능력이 부족할 것입니다. 계통 추적 기술의 새로운 발전은 재생 중 세포의 활성화, 분화 및 이동을 추적할 수 있게 해주며, 장에서 이를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 본 연구는 방사선 손상 후 마우스 장 상피 내 세포를 분석하는 방법을 제시하는 것을 목적으로 한다.

Introduction

인간의 장 상피는 완전히 평평하게 놓으면 배드민턴 코트의 절반 표면을 덮을 것입니다1. 대신, 인간의 내장 내용물을 분리하는 이 단일 세포층은 일련의 손가락 모양의 돌기, 융모 및 움푹 들어간 곳, 장의 표면적을 최대화하는 선와로 압축됩니다. 상피의 세포는 crypt-villus 축을 따라 분화합니다. 융모는 주로 영양소를 흡수하는 장세포, 점액을 분비하는 잔 세포, 호르몬을 생성하는 장내분비 세포로 구성되며, 선와(crypt)는 주로 디펜신 생성 파네스 세포, 활성 및 예비 줄기 세포, 전구 세포 2,3,4,5로 구성됩니다. 또한, 이들 세포가 밑에 있는 중간엽 구획의 기질 및 면역 세포 및 내강의 미생물군과 갖는 양방향 통신은 장 항상성을 유지하고 손상 후 회복에 중요한 복잡한 상호 작용 네트워크를 생성합니다 6,7,8.

장 상피는 인체에서 가장 빠르게자가 재생되는 조직이며 회전율은 2-6 일 9,10,11입니다. 항상성 동안, 류신이 풍부한 반복 함유 G-단백질 결합 수용체 5(LGR5)의 발현으로 특징지어지는 장 선와(orbit base columnar cells)의 기저부에 있는 활성 줄기 세포는 빠르게 분열하여 다른 모든 장 상피 계통으로 분화하는 전구 세포를 제공합니다. 그러나, 이들의 높은 유사분열 속도 때문에, 활성 줄기 세포 및 이들의 직계 전구체는 감마선 손상에 특히 민감하며, 방사선 조사후 세포자멸사를 겪는다 5,12,13,14. 소실되면 장내 선와(異聓) 내의 예비 줄기세포와 비줄기세포(전구체 및 일부 말기 분화된 세포의 소집단)가 활성화되어 기저음와구획(basal crypt compartment)을 보충하여 융모의 세포군을 재구성하여 장 상피(intestinal epithelium)를 재생시킨다15. 혈통 추적 기술을 사용하여 여러 연구 그룹은 예비 (정지) 줄기 세포가 활성 줄기 세포 13,16,17,18,19,20,21,22의 손실시 재생을 지원할 수 있음을 입증했습니다. 이 세포는 폴리콤 복합 단백질 1 종양 유전자(Bmi1), 마우스 텔로머라제 역전사 효소 유전자(mTert), 홉 호메오박스(Hopx) 및 류신이 풍부한 반복 단백질 1 유전자(Lrig1)의 존재를 특징으로 합니다. 또한, 비 줄기 세포는 손상 23,24,25,26,27,28,29,30,31시 장 선와를 보충 할 수 있음이 밝혀졌습니다. 특히, 분비 세포 및 장 세포의 전구 세포는 손상시 탈분화를 겪고, 줄기 유사 세포로 되돌아 가며, 장 상피의 재생을 지원하는 것으로 나타났다. 최근 연구에서는 손상 시 줄기와 유사한 특성을 획득할 수 있는 능력을 가진 여러 마커(예: DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)를 발현하는 세포를 확인했습니다.32,33,34,35,36. 놀랍게도, Yu et al. 성숙한 파네스 세포(LYZ+)도 장 재생에 기여할 수 있음을 보여주었다37. 또한, 방사선 조사는 장 상피 세포의 세포 사멸을 유발하고 상피 장벽 기능을 방해하는 것 외에도 장내 세균총의 dysbiosis, 면역 세포 활성화 및 전 염증 반응의 시작, 중간 엽 및 기질 세포의 활성화를 초래합니다38,39.

감마선은 암 치료, 특히 결장직장 종양의 경우 귀중한 치료 도구이다40. 그러나 방사선 조사는 세포 손상을 유도하여 장 항상성에 큰 영향을 미치고, 이는 세포 사멸을 유발합니다. 방사선 노출은 환자의 회복을 늦추는 다중 섭동을 유발하며 급성기의 점막 손상 및 염증과 장기간의 설사, 요실금, 출혈 및 복통으로 표시됩니다. 이러한 증상의 파노라마를 위장 방사선 독성이라고 합니다. 또한, 경벽 섬유증 및/또는 혈관 경화증의 방사선 유발 진행은 치료 후 몇 년 후에 나타날 수 있습니다38,41. 손상 자체와 동시에, 방사선은 재생을 시작하고 조율하는 신호 전달 경로를 활성화하는 장 세포에서 복구 반응을 유도합니다42. 방사선 유발 소장 질환은 다른 장기 (예 : 자궁 경부, 전립선, 췌장, 직장)에 제공되는 골반 또는 복부 방사선 요법으로 인해 발생할 수 있습니다 41,43,44,45,46. 따라서 장 방사선 조사 손상은 중요한 임상적 문제이며 결과적인 병태생리학에 대한 더 나은 이해는 방사선 요법과 관련된 위장 합병증을 완화하기 위한 중재의 개발을 진전시킬 가능성이 있습니다. 방사선 외에 장 상피의 재생 목적을 조사할 수 있는 다른 기술이 있습니다. 염증 및 그 후의 재생을 연구하기 위한 형질전환 및 화학적 쥐 모델이 개발되었다47. 덱스트란 황산나트륨(DSS)은 장에서 염증을 유발하고 염증성 장 질환과 유사한 특성을 발달시킨다48. DSS 치료와 발암 성 화합물 인 아족시 메탄 (AOM)의 조합은 대장염 관련 암의 발병을 초래할 수 있습니다48,49. 허혈 재관류 유발 손상은 장 상피의 재생 가능성을 연구하는 데 사용되는 또 다른 방법입니다. 이 기술은 경험과 외과 지식이 필요합니다50. 또한, 앞서 언급 한 기술은 방사선과 다른 유형의 부상을 유발하고 다른 재생 메커니즘의 개입으로 이어질 수 있습니다. 또한 이러한 모델은 시간이 많이 걸리고 방사선 기술은 상당히 간단합니다. 최근, 장 재생의 기전을 연구하기 위해 장과 결장에서 생성된 엔테로이드와 콜로노이드를 방사선 손상과 병용하여 사용하는 시험관 내 방법이 사용되고 있다51,52. 그러나 이러한 기술은 그들이 모델링하는 기관을 완전히 요약하지 않습니다53,54.

제시된 프로토콜에는 타목시펜 치료 후 예비 줄기 세포 집단(Bmi1-CreER; Rosa26eYFP입니다. 이 모델은 12 Gy 전신 방사선 조사를 이용하는데, 이는 예비 줄기 세포를 활성화시키기에 충분히 상당한 장 손상을 유도하는 동시에 손상 후 7일 이내에 장 재생 능력의 후속 조사를 허용한다55.

Protocol

모든 마우스는 스토니 브룩 대학 (Stony Brook University)의 실험실 동물 자원 부서 (DLAR)에 수용되었습니다. Stony Brook University IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)는 동물 피험자와 관련된 모든 연구와 절차를 승인했습니다. 동물 피험자를 대상으로 한 실험은 승인된 동물 취급 프로토콜(IACUC #245094)에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 참고: 마우스 균주 B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J(Bmi1-Cre…

Representative Results

쥐의 유전적 혈통 추적과 함께 12Gy 전신 방사선 조사(TBI)를 사용하면 장내 방사선 손상의 결과를 철저히 분석할 수 있습니다. 시작하려면 Bmi1-CreER; Rosa26eYFP 마우스는 Bmi1+ 예비 줄기 세포 집단 내에서 향상된 황색 형광 단백질(EYFP) 발현을 유도하는 단일 타목시펜 주사를 받았습니다. 타목시펜 주사 이틀 후, 마우스는 방사선 조사 또는 가짜 방사선 조사를 받았다. 안?…

Discussion

이 프로토콜은 강력하고 재현 가능한 방사선 손상 모델을 설명합니다. 이를 통해 손상 후 7일 동안 장 상피의 변화를 정확하게 분석할 수 있습니다. 중요하게도, 선택된 시점은 손상의 중요한 단계를 반영하며 장의 뚜렷한 변화(손상, 세포자멸사, 재생 및 정상화 단계)를 특징으로 합니다60. 이 방사선 조사 모델은 확립되고 신중하게 평가되어 방사선 요법을 받는 환자가 경험하는…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 조직 표본 준비에 대한 전문가의 도움을 받은 Stony Brook Cancer Center Histology Research Core와 동물 관리 및 취급에 대한 지원을 제공한 Stony Brook University의 실험실 동물 자원 부서에 감사를 표하고자 합니다. 이 연구는 Agnieszka B. Bialkowska와 Vincent W. Yang 박사에게 수여된 DK052230에 수여된 국립 보건원 DK124342의 보조금으로 지원되었습니다.

Materials

1 mL syringe BD 309659 –
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 –
27G x 1/2" needle BD 305109 –
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 –
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 –
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 –
Corn oil Millipore-Sigma C8267 –
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 –
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV –
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. – 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 –
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 –
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 –
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT –
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 –
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
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Keywords: Intestinal Epithelial RegenerationIonizing RadiationGamma IrradiationColorectal CancerLineage TracingTamoxifenEdUBouin’s FixativeGamma IrradiatorCre-mediated Recombination
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Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).
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