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Biologia

Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante

Published: July 27, 2022
doi:
10.3791/64028
, , , ,
1Department of Medicine,Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics,Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

O trato gastrointestinal é um dos órgãos mais sensíveis à lesão no tratamento radioterápico do câncer. É simultaneamente um sistema orgânico com uma das mais altas capacidades regenerativas após tais insultos. O protocolo apresentado descreve um método eficiente para estudar a capacidade regenerativa do epitélio intestinal.

Abstract

O epitélio intestinal consiste de uma única camada de células, mas contém múltiplos tipos de células terminalmente diferenciadas, que são geradas pela proliferação ativa de células-tronco intestinais localizadas no fundo das criptas intestinais. No entanto, durante eventos de lesão intestinal aguda, essas células-tronco intestinais ativas sofrem morte celular. A irradiação gama é um tratamento de câncer colorretal amplamente utilizado, que, embora terapeuticamente eficaz, tem o efeito colateral de esgotar o pool ativo de células-tronco. De fato, os pacientes frequentemente experimentam síndrome de radiação gastrointestinal durante a radioterapia, em parte devido à depleção ativa de células-tronco. A perda de células-tronco intestinais ativas em criptas intestinais ativa um pool de células-tronco intestinais de reserva tipicamente quiescentes e induz a desdiferenciação de células precursoras secretoras e enterocitárias. Se não fossem essas células, o epitélio intestinal não teria a capacidade de se recuperar da radioterapia e de outros grandes insultos teciduais. Novos avanços em tecnologias de rastreamento de linhagem permitem o rastreamento da ativação, diferenciação e migração de células durante a regeneração e têm sido empregados com sucesso para estudar isso no intestino. Este estudo tem como objetivo descrever um método para a análise de células dentro do epitélio intestinal de camundongos após lesão por radiação.

Introduction

O epitélio intestinal humano cobriria aproximadamente a superfície de meia quadra de badminton se colocado completamente plano1. Em vez disso, essa única camada de células que separa os humanos do conteúdo de seus intestinos é compactada em uma série de projeções semelhantes a dedos, vilosidades e reentrâncias, criptas que maximizam a área de superfície dos intestinos. As células do epitélio diferenciam-se ao longo de um eixo cripta-vilosidade. As vilosidades consistem principalmente de enterócitos absorvedores de nutrientes, células caliciformes secretoras de muco e células enteroendócrinas produtoras de hormônios, enquanto as criptas consistem principalmente de células Paneth produtoras de defensina, células-tronco ativas e de reserva e células progenitoras 2,3,4,5. Além disso, a comunicação bidirecional dessas células com as células estromais e imunes do compartimento mesenquimal subjacente e a microbiota do lúmen gera uma complexa rede de interações que mantém a homeostase intestinal e é fundamental para a recuperação após a lesão6,7,8.

O epitélio intestinal é o tecido que mais rapidamente se auto-renova no corpo humano, com taxa de turnover de 2-6 dias 9,10,11. Durante a homeostase, células-tronco ativas na base das criptas intestinais (células colunares da base das criptas), marcadas pela expressão do receptor acoplado à proteína G 5 (LGR5), rico em leucina, rapidamente se dividem e fornecem células progenitoras que se diferenciam em todas as outras linhagens epiteliais intestinais. No entanto, devido à sua alta taxa mitótica, as células-tronco ativas e seus progenitores imediatos são particularmente sensíveis à lesão por radiação gama e sofrem apoptose após irradiação 5,12,13,14. Ao serem perdidas, células-tronco de reserva e não-células-tronco (subpopulação de progenitores e algumas células terminalmente diferenciadas) dentro das criptas intestinais sofrem ativação e reposição do compartimento criptário basal, que pode então reconstituir populações celulares das vilosidades e, assim, regenerar o epitélio intestinal15. Utilizando técnicas de rastreamento de linhagens, vários grupos de pesquisa têm demonstrado que células-tronco de reserva (quiescentes) são capazes de suportar a regeneração após a perda de células-tronco ativas 13,16,17,18,19,20,21,22. Essas células são caracterizadas pela presença do oncogene da proteína 1 do complexo policomb (Bmi1), do gene da transcriptase reversa da telomerase de camundongo (mTert), da homeobox de Hop (Hopx) e do gene da proteína 1 de repetição rica em leucina (Lrig1). Além disso, tem sido demonstrado que as células não estaminais são capazes de repor criptas intestinais em caso de lesão23,24,25,26,27,28,29,30,31. Em particular, tem sido demonstrado que progenitores de células secretoras e enterócitos sofrem desdiferenciação após lesão, revertem para células-tronco semelhantes e suportam a regeneração do epitélio intestinal. Estudos recentes identificaram células expressando múltiplos marcadores que possuem a capacidade de adquirir características semelhantes ao tronco no momento da lesão (como DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Surpreendentemente, Yu e col. mostraram que mesmo células Paneth maduras (LYZ+) podem contribuir para a regeneração intestinal37. Além disso, além de causar apoptose das células epiteliais intestinais e interromper a função da barreira epitelial, a irradiação resulta em disbiose da flora intestinal, ativação de células imunes e início de resposta pró-inflamatória, ativação de células mesenquimais e estromais38,39.

A radiação gama é uma ferramenta terapêutica valiosa no tratamento do câncer, especialmente para os tumorescolorretais40. No entanto, a irradiação afeta significativamente a homeostase intestinal, induzindo danos às células, o que leva à apoptose. A exposição à radiação causa múltiplas perturbações que retardam a recuperação do paciente e é marcada por lesão da mucosa e inflamação na fase aguda e diarreia, incontinência, sangramento e dor abdominal a longo prazo. Essa panóplia de manifestações é referida como toxicidade por radiação gastrointestinal. Além disso, a progressão da fibrose transmural e/ou esclerose vascular induzida pela radiação só pode se manifestar anos após o tratamento38,41. Simultaneamente à própria lesão, a radiação induz uma resposta de reparo nas células intestinais que ativa as vias de sinalização responsáveis por iniciar e orquestrar a regeneração42. A doença do intestino delgado induzida pela radiação pode originar-se da radioterapia pélvica ou abdominal fornecida a outros órgãos (como colo do útero, próstata, pâncreas, reto)41,43,44,45,46. A lesão por irradiação intestinal é, portanto, um problema clínico significativo, e um melhor entendimento da fisiopatologia resultante provavelmente fará avançar o desenvolvimento de intervenções para aliviar as complicações gastrointestinais associadas à radioterapia. Existem outras técnicas que permitem investigar a finalidade regenerativa do epitélio intestinal além da radiação. Modelos murinos transgênicos e químicos para estudar a inflamação e a regeneração a partir de então têm sido desenvolvidos47. O sulfato de sódio dextran (DSS) induz inflamação no intestino e leva ao desenvolvimento de características semelhantes às da doença inflamatória intestinal48. A combinação do tratamento da ESD com o composto pró-carcinogênico azoximetano (AOM) pode resultar no desenvolvimento de câncer associado à colite48,49. A lesão induzida por isquemia e reperfusão é outro método empregado para estudar o potencial regenerativo do epitélio intestinal. Esta técnica requer experiência e conhecimento cirúrgico50. Além disso, as técnicas citadas causam diferentes tipos de lesão do que a radiação e podem levar ao envolvimento de diferentes mecanismos de regeneração. Além disso, esses modelos são demorados, enquanto a técnica de radiação é bastante breve. Recentemente, métodos in vitro utilizando enteróides e colonóides gerados a partir do intestino e cólon têm sido utilizados em combinação com a lesão por radiação para estudar os mecanismos de regeneração intestinal51,52. No entanto, essas técnicas não recapitulam completamente o órgão quemodelam53,54.

O protocolo apresentado inclui a descrição de um modelo murino de lesão por radiação gama em combinação com um modelo genético que, após o tratamento com tamoxifeno, permite o rastreamento de linhagens originárias da população de células-tronco de reserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Esse modelo utiliza uma irradiação de corpo total de 12 Gy, que induz lesão intestinal significativa o suficiente para ativar células-tronco de reserva, ao mesmo tempo em que permite a investigação subsequente da capacidade regenerativa intestinal dentro de 7 dias após a lesão55.

Protocol

Todos os camundongos foram alojados na Divisão de Recursos Animais de Laboratório (DLAR) da Stony Brook University. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Stony Brook University (IACUC) aprovou todos os estudos e procedimentos envolvendo cobaias animais. Os experimentos envolvendo animais foram conduzidos estritamente de acordo com o protocolo aprovado de manejo de animais (IACUC #245094). NOTA: As estirpes de rato B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) e B6.129X1-Gt(<e…

Representative Results

O uso de irradiação de corpo total (TCE) de 12 Gy em combinação com o rastreamento de linhagem genética murina permite uma análise completa das consequências da lesão por radiação no intestino. Para começar, Bmi1-CreER; Camundongos Rosa26eYFP receberam uma única injeção de tamoxifeno, que induz a expressão aumentada da proteína fluorescente amarela (EYFP) dentro de uma população de células-tronco de reserva Bmi1+ . Dois dias após a injeção de tamoxifeno, os …

Discussion

Este protocolo descreve um modelo robusto e reprodutível de lesão por radiação. Permite a análise precisa das alterações no epitélio intestinal ao longo de 7 dias pós-lesão. É importante ressaltar que os momentos selecionados refletem estágios cruciais da lesão e são caracterizados por alterações distintas no intestino (lesão, apoptose, regeneração e fases de normalização)60. Esse modelo de irradiação foi estabelecido e cuidadosamente avaliado, demonstrando uma manifestaçã…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores desejam agradecer ao Stony Brook Cancer Center Histology Research Core pela assistência especializada com a preparação de espécimes de tecido e à Divisão de Recursos de Animais de Laboratório da Stony Brook University pela assistência com cuidados e manuseio de animais. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde DK124342 concedidos a Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 ao Dr. Vincent W. Yang.

Materials

1 mL syringe BD 309659 –
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 –
27G x 1/2" needle BD 305109 –
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 –
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 –
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 –
Corn oil Millipore-Sigma C8267 –
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 –
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV –
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. – 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 –
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 –
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 –
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT –
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 –
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
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Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).
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