Modello cutaneo di xenotrapianto per manipolare le risposte immunitarie umane in vivo
Summary
Il presente protocollo descrive come innestare la pelle umana su topi del recettore della catena gamma (NSG) diabetici non obesi (NOD)-scid. Una descrizione dettagliata della preparazione della pelle umana per il trapianto, la preparazione di topi per il trapianto, il trapianto di pelle umana a spessore diviso e la procedura di recupero post-trapianto sono inclusi nella relazione.
Abstract
Il modello di xenotrapianto di pelle umana, in cui la pelle di un donatore umano viene trapiantata su un ospite di topo immunodeficiente, è un’opzione importante per la ricerca traslazionale in immunologia cutanea. La pelle murina e umana differiscono sostanzialmente nell’anatomia e nella composizione delle cellule immunitarie. Pertanto, i modelli murini tradizionali hanno limitazioni per la ricerca dermatologica e la scoperta di farmaci. Tuttavia, gli xenotrapianti di successo sono tecnicamente impegnativi e richiedono una preparazione ottimale del campione e del sito di innesto di topo per la sopravvivenza dell’innesto e dell’ospite. Il presente protocollo fornisce una tecnica ottimizzata per il trapianto di pelle umana sui topi e discute le considerazioni necessarie per gli obiettivi sperimentali a valle. Questo rapporto descrive la preparazione appropriata di un campione di pelle di donatore umano, l’assemblaggio di una configurazione chirurgica, la preparazione del topo e del sito chirurgico, il trapianto di pelle e il monitoraggio post-chirurgico. L’aderenza a questi metodi consente il mantenimento degli xenotrapianti per oltre 6 settimane dopo l’intervento. Le tecniche descritte di seguito consentono la massima efficienza dell’innesto grazie allo sviluppo di controlli ingegneristici, tecniche sterili e condizionamento pre e post-chirurgico. L’esecuzione appropriata del modello di xenotrapianto si traduce in campioni di innesto di pelle umana di lunga durata per la caratterizzazione sperimentale della pelle umana e test preclinici di composti in vivo.
Introduction
I modelli murini sono spesso usati per fare inferenze sulla biologia umana e sulle malattie, in parte a causa della loro riproducibilità sperimentale e della capacità di manipolazione genetica. Tuttavia, la fisiologia del topo non ricapitola completamente i sistemi di organi umani, in particolare la pelle, e quindi ha limitazioni per l’uso come modello preclinico nello sviluppo di farmaci1. Le differenze anatomiche tra la pelle del topo e quella umana includono differenze negli spessori epiteliali e nell’architettura, mancanza di ghiandole sudoripare eccrine murine e variazioni nel ciclo dei capelli2. Inoltre, sia il braccio innato che quello adattativo del sistema immunitario sono divergenti tra le due specie3. La pelle di topo contiene una popolazione immunitaria unica di cellule T epidermiche dendritiche (DETC), ha una maggiore abbondanza di cellule T γδ dermiche e varia nella localizzazione del sottogruppo di cellule immunitarie rispetto al tessuto umano4. Pertanto, i risultati sperimentali riguardanti la biologia della pelle umana e l’infiammazione beneficiano della convalida con tessuto umano. Mentre i sistemi di coltura in vitro e organoidi sono strumenti ampiamente utilizzati per studiare il tessuto umano, questi sistemi sono limitati dalla ricostituzione immunitaria assente o incompleta e dalla mancanza di connessione con la vascolarizzazione periferica5. Il modello umanizzato di trapianto di pelle di xenotrapianto mira a consentire la manipolazione terapeutica o biologica di percorsi immunitari e non immunitari nei tessuti umani in vivo.
Il modello di xenotrapianto di pelle umana è stato utilizzato per studiare la fisiologia e la farmacologia della pelle, analizzare il rigetto immunitario e le risposte, analizzare i meccanismi del cancro della pelle umana e comprendere le malattie della pelle e la guarigione delle ferite6. Sebbene applicabile a più campi della ricerca sulla pelle, il modello di xenotrapianto ha un rendimento inferiore rispetto agli studi in vitro e manca della facilità di manipolazione genetica impiegata nei modelli murini. I punti temporali all’interno di questo modello possono variare da settimane a mesi e l’innesto di successo richiede strutture e attrezzature adeguate per eseguire questi interventi chirurgici. Tuttavia, il modello di xenotrapianto fornisce un contesto biologico e fisiologico agli esperimenti, mentre i sistemi di coltura organoide, come gli espianti di tessuto, spesso richiedono la replica di una miriade di parti mobili, come i segnali esogeni, a specifici intervalli di tempo7. Pertanto, questo modello è meglio utilizzato per convalidare ulteriormente i risultati osservati in vitro e all’interno di modelli murini, o per lavori che non sono altrimenti biologicamente fattibili. L’uso appropriato del modello di xenotrapianto offre un’opportunità unica per studiare e manipolare il tessuto umano intatto in vivo.
L’ottimizzazione del modello di trapianto di pelle di xenotrapianto si è basata su decenni di ricerca per preservare l’integrità dell’innesto nel tempo. Fondamentale per questo processo è l’utilizzo del topo del recettore della catena gamma (NSG) del diabete non obeso (NOD)-scid, che manca di cellule immunitarie adattative B e T, cellule NK funzionali e ha carenze nei macrofagi e nelle cellule dendritiche8. La natura immunodeficiente di questi ospiti NSG consente il trapianto di cellule ematopoietiche umane, tumori derivati dal paziente e pelle 8,9,10. Nonostante questo ambiente ospite immunosoppressivo, è necessaria un’ulteriore soppressione delle risposte immunitarie neutrofile del topo mediante somministrazione di anti-GR1 per il successo del trapianto10. I principali ostacoli nel trapianto di tessuto intatto sono l’infezione, il rigetto e la difficoltà di ristabilire il flusso sanguigno all’innesto, che a volte porta alla perdita dell’integrità dermica ed epidermica11. Le tecniche che includono la somministrazione di anti-FR1 e l’uso di un’appropriata profondità di innesto migliorano la sopravvivenza del trapianto10. L’ottimizzazione meticolosa consente di eseguire trapianti di pelle di xenotrapianto umano su topi NSG con alti tassi di efficienza e sopravvivenza, compresi tra il 90% e il 100%.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto di topo è una tecnica chiave per sezionare meccanicamente le risposte immunitarie della pelle umana in un ambiente in vivo 14. Il successo dei trapianti di xenotrapianto cutaneo si basa su un’adeguata preparazione di topi e campioni di pelle e topi e sull’aderenza ai metodi di chirurgia asettica dei roditori15. Il raffreddamento rapido e la corretta conservazione dei campioni di pelle a basse temperature in terreni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato in parte da accordi di ricerca sponsorizzati da TRex Bio e sovvenzioni dal NIH (1R01AR075864-01A1). JMM è sostenuto dalla Cancer Research Society (sovvenzione 26005). Riconosciamo il Parnassus Flow Cytometry Core supportato in parte dalle sovvenzioni NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 e S10 1S10OD018040-01.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
Riferimenti
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