Modelo de piel de xenoinjerto para manipular las respuestas inmunes humanas in vivo
Summary
El presente protocolo describe cómo injertar piel humana en ratones diabéticos no obesos (NOD)-scid receptor de cadena gamma (NSG) con interleucina-2. En el informe se incluye una descripción detallada de la preparación de la piel humana para el trasplante, la preparación de ratones para el trasplante, el trasplante de piel humana de espesor dividido y el procedimiento de recuperación posterior al trasplante.
Abstract
El modelo de xenoinjerto de piel humana, en el que la piel de un donante humano se trasplanta a un huésped de ratón inmunodeficiente, es una opción importante para la investigación traslacional en inmunología de la piel. La piel murina y humana difieren sustancialmente en anatomía y composición de células inmunes. Por lo tanto, los modelos tradicionales de ratón tienen limitaciones para la investigación dermatológica y el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, los xenotrasplantes exitosos son técnicamente desafiantes y requieren una preparación óptima del sitio de injerto de muestra y ratón para la supervivencia del injerto y del huésped. El presente protocolo proporciona una técnica optimizada para trasplantar piel humana en ratones y discute las consideraciones necesarias para los objetivos experimentales posteriores. Este informe describe la preparación adecuada de una muestra de piel de donante humano, el ensamblaje de una configuración quirúrgica, la preparación del ratón y del sitio quirúrgico, el trasplante de piel y el monitoreo postquirúrgico. La adherencia a estos métodos permite el mantenimiento de los xenoinjertos durante más de 6 semanas después de la cirugía. Las técnicas descritas a continuación permiten la máxima eficiencia de injerto debido al desarrollo de controles de ingeniería, técnica estéril y acondicionamiento pre y postquirúrgico. El rendimiento adecuado del modelo de xenoinjerto da como resultado muestras de injerto de piel humana de larga vida para la caracterización experimental de la piel humana y las pruebas preclínicas de compuestos in vivo.
Introduction
Los modelos de ratón se utilizan con frecuencia para hacer inferencias sobre la biología humana y la enfermedad, en parte debido a su reproducibilidad experimental y capacidad de manipulación genética. Sin embargo, la fisiología del ratón no recapitula completamente los sistemas de órganos humanos, particularmente la piel, y por lo tanto tiene limitaciones para su uso como modelo preclínico en el desarrollo de fármacos1. Las diferencias anatómicas entre la piel del ratón y la humana incluyen diferencias en el grosor epitelial y la arquitectura, la falta de glándulas sudoríparas ecrinas murinas y las variaciones en el ciclo del cabello2. Además, tanto el brazo innato como el adaptativo del sistema inmune son divergentes entre las dos especies3. La piel de ratón contiene una población inmune única de células T epidérmicas dendríticas (DETC), tiene una mayor abundancia de células T γδ dérmicas y varía en la localización de subconjuntos de células inmunes en comparación con el tejido humano4. Por lo tanto, los hallazgos experimentales sobre la biología de la piel humana y la inflamación se benefician de la validación con tejido humano. Mientras que los sistemas de cultivo in vitro y organoides son herramientas ampliamente utilizadas para estudiar el tejido humano, estos sistemas están limitados por la reconstitución inmune ausente o incompleta y la falta de conexión con la vasculatura periférica5. El modelo humanizado de trasplante de piel de xenoinjerto tiene como objetivo permitir la manipulación terapéutica o biológica de las vías inmunes y no inmunes en tejidos humanos in vivo.
El modelo de xenoinjerto de piel humana se ha utilizado para estudiar la fisiología y farmacología de la piel, analizar el rechazo inmune y las respuestas, diseccionar los mecanismos del cáncer de piel humano y comprender las enfermedades de la piel y la cicatrización de heridas6. Si bien es aplicable a múltiples campos de investigación de la piel, el modelo de xenoinjerto tiene un rendimiento menor que los estudios in vitro y carece de la facilidad de manipulación genética empleada en modelos de ratón. Los puntos de tiempo dentro de este modelo pueden variar de semanas a meses, y el injerto exitoso requiere instalaciones y equipos adecuados para realizar estas cirugías. Sin embargo, el modelo de xenoinjerto proporciona contexto biológico y fisiológico a los experimentos, mientras que los sistemas de cultivo de organoides, como los explantes de tejidos, a menudo requieren replicar una miríada de partes móviles, como señales exógenas, a intervalos de tiempo específicos7. Por lo tanto, este modelo se utiliza mejor para validar aún más los hallazgos observados in vitro y dentro de modelos de ratón, o para trabajos que no son biológicamente factibles. El uso apropiado del modelo de xenoinjerto ofrece una oportunidad única para estudiar y manipular tejido humano intacto in vivo.
La optimización del modelo de trasplante de piel de xenoinjerto se ha basado en décadas de investigación para preservar la integridad del injerto a lo largo del tiempo. Fundamental para este proceso es utilizar el ratón receptor de cadena gamma (NSG) diabético no obeso (NOD)-scid interleucina-2, que carece de células inmunes adaptativas B y T, células NK funcionales y tiene deficiencias en macrófagos y células dendríticas8. La naturaleza inmunodeficiente de estos huéspedes NSG permite el trasplante de células hematopoyéticas humanas, cánceres derivados de pacientes y piel 8,9,10. A pesar de este ambiente inmunosupresor del huésped, la supresión adicional de las respuestas inmunes neutrofílicas del ratón mediante la administración anti-GR1 es necesaria para el éxito del injerto10. Los principales obstáculos en el trasplante de tejido intacto son la infección, el rechazo y la dificultad para restablecer el flujo sanguíneo al injerto, lo que a veces conduce a la pérdida de integridad dérmica y epidérmica11. Las técnicas que incluyen la administración de anti-FR1 y el uso de una profundidad de injerto adecuada mejoran la supervivencia del injerto10. La optimización meticulosa permite realizar trasplantes de piel de xenoinjerto humano en ratones NSG con altas tasas de eficiencia y supervivencia, que oscilan entre el 90% y el 100%.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de trasplante de piel de xenoinjerto de ratón es una técnica clave para diseccionar mecánicamente las respuestas inmunes de la piel humana en un entorno in vivo 14. El éxito de los trasplantes de xenoinjerto de piel se basa en la preparación adecuada de ratones y muestras de piel y ratones y en la adherencia a los métodos de cirugía aséptica con roedores15. El enfriamiento rápido y el almacenamiento adecuado de muestras de piel a temperaturas fr?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por acuerdos de investigación patrocinados por TRex Bio y subvenciones de los NIH (1R01AR075864-01A1). JMM cuenta con el apoyo de la Sociedad de Investigación del Cáncer (subvención 26005). Reconocemos el Parnassus Flow Cytometry Core apoyado en parte por las subvenciones NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 y S10 1S10OD018040-01.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
Riferimenti
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