ダウアー幼虫の大規模グラビタキシスアッセイ
Summary
本プロトコルは、 カエノラブディティス ・ダウアー幼虫を用いて大規模な重力試験を実施するための方法を概説する。このプロトコルにより、プレートベースのアッセイと比較して、グラビタキシスの挙動をより適切に検出できます。
Abstract
重力感覚は重要で比較的研究されていないプロセスです。重力を感知することで、動物は周囲をナビゲートし、動きを容易にすることができます。さらに、哺乳類の内耳で発生する重力感覚は聴覚と密接に関連しているため、このプロセスを理解することは、聴覚および前庭研究に影響を及ぼします。グラビタキシスアッセイは、 ショウジョウバエを含むいくつかのモデル生物に存在します。単一のワームは、溶液に定着する際の配向の好みについて以前にアッセイされています。ただし、 カエノラブディティス グラビタキシスの信頼性が高く堅牢なアッセイは記載されていません。.本プロトコルは、一度に数百の カエノラブディティス ダウアーを試験するために使用できるグラビタキシスアッセイを実行するための手順を概説しています。この大規模な長距離アッセイにより、詳細なデータ収集が可能になり、標準的なプレートベースのアッセイでは見逃される可能性のある表現型が明らかになります。垂直軸に沿ったダウアーの動きを水平コントロールと比較し、方向バイアスが重力によるものであることを確認します。次いで、重力選好を、菌株間または実験条件間で比較することができる。この方法は、ワームの重力症の分子、細胞、および環境要件を決定できます。
Introduction
地球の引力を感知することは、多くの生物の方向、動き、調整、およびバランスにとって非常に重要です。しかし、重力感覚の分子機構や神経回路は、他の感覚に比べてよくわかっていません。動物では、重力感覚は相互作用し、行動に影響を与えるために他の刺激と競争することができます。視覚的手がかり、固有受容感覚的フィードバック、および前庭情報を統合して、動物の周囲に対する身体意識の感覚を生成することができる1,2。逆に、重量性嗜好は、他の刺激の存在下で変化させることができる3、4、5。したがって、重力行動は、重力感覚を研究し、神経系の複雑な感覚統合と意思決定を理解するのに理想的です。
C. elegansは、そのポリフェニックライフサイクルのために、グラビタキシスを研究するための特に有用なモデル生物です。発育中に熱、過密、食物不足などのストレッサーにさらされると、C.エレガンスの幼虫はストレス耐性の高いダウアーに成長します6。ダウアーとして、ワームは、ワームが尾に「立ち」、頭を振るニクテーションなどの特徴的な行動を実行し、より良い生息地への分散を促進する可能性があります7。C. elegansとC. japonicaのGravitaxisアッセイは、ダウアー幼虫が負の重力を負にすることを示唆しており、この行動は成虫よりもダウアーでより容易に観察されます8,9。他のカエノラブディティス株でグラビタキシスをテストすると、重力作用の自然な変化が明らかになる可能性があります。.
重力感覚のメカニズムは、ユーグレナ、ショウジョウバエ、シオナ、およびその他のさまざまな種で、グラビタキシスアッセイ3、10、11を使用して特徴付けられています。一方、カエノラブディティスのグラビタキシス研究では、当初はさまざまな結果が得られました。C. elegansの配向選好に関する研究では、ワームは溶液中で頭を下にして配向し、正の重力嗜好を示唆していることがわかりました12。一方、C. japonica dauersは早い段階で負の重力8であることが確認されていましたが、この行動はC. elegans9で最近記述されたばかりです。ワームの代表的なグラビタキシスアッセイの開発には、いくつかの課題が生じます。カエノラブディティス株は寒天プレート上で維持されます。このため、行動アッセイは通常、実験デザインの一部として寒天プレートを使用します13、14、15。カエノラブディティスで最も早く報告された重力試験は、水平コントロールプレート8に対して90°の角度でプレートを横に立てることによって実行されました。ただし、重力タクシーの挙動は、これらの条件下で常に堅牢であるとは限りません。.成虫は溶液12で向きの好みをアッセイできますが、この方向の好みは状況に依存する可能性があり、ワームが泳ぐのではなく這っている場合は異なる行動につながります。さらに、C.エレガンスは、重力9に対するそれらの応答を妨げる光および電磁場16,17を含む他の刺激に敏感である。したがって、他の環境変数から保護する最新の重力試験は、この感覚プロセスのメカニズムを分析するために重要です。
本プロトコールでは、カラビタキシスを観察するためのアッセイが記載されている。この研究のセットアップは、神経筋の完全性を研究するために開発された方法に部分的に基づいています18,19。ダウアー幼虫を培養し、標準的な手順20を用いて単離する。次に、寒天で満たされた2つの5 mL血清学的ピペットから作られたチャンバーに注入されます。これらのチャンバーは、垂直または水平に向けることができ、暗いファラデーケージ内に12〜24時間配置して、光および電磁界から遮蔽することができます。チャンバー内の各ワームの位置が記録され、C.エレガンスN2などの基準株の垂直タクシーと比較されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
従来工法との比較
走化性とは異なり、 カエノラブディティス のグラビタキシスは、従来の寒天プレート実験デザインを使用して確実に観察することはできません。標準的なペトリ皿は直径150mmで、ダウアーが重力の好みを示すためにどちらの方向にも75mmしか利用できません。 C. elegansの 配向選好は溶液12でアッセイできますが、この方法はワー…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、米国国立衛生研究所からJHRへの研究助成金(#R01 5R01HD081266および#R01GM141493)の支援を受けて行われました。一部の菌株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供されました。プラディープ・ジョシ(UCSB)の編集上の意見に感謝します。UCSB DATALABが提供する統計コンサルティング。
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
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